शुरू करने के लिए, एक छह अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 1% बाह्य मैट्रिक्स के एक मिलीलीटर जोड़ें. एक 5% कार्बन डाइऑक्साइड वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं. एक घंटे के बाद, प्रत्येक कुएं में 0.4 माइक्रोमोलर Y-27632 युक्त प्रीवार्म रखरखाव माध्यम के दो मिलीलीटर जोड़ें।
एच 9 भ्रूण स्टेम कोशिकाओं को पिघलाने के लिए, क्रायोवियल स्टॉक को 30 सेकंड के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में हिलाएं। क्रायोवियल को 75% कीटाणुनाशक अल्कोहल स्प्रे से सावधानीपूर्वक निष्फल करें। फिर पिघली हुई कोशिकाओं को रखरखाव माध्यम और Y-27632 युक्त 15 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें।
कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए 190 ग्राम पर ट्यूब अपकेंद्रित्र. फिर ध्यान से सतह पर तैरनेवाला के सबसे हटा दें और Y-27632 युक्त रखरखाव माध्यम के एक मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें. रखरखाव माध्यम युक्त बाह्य मैट्रिक्स लेपित प्लेट के प्रत्येक कुएं के लिए सेल निलंबन के 0.5 मिलीलीटर बांटना।
प्लेट को पार्श्व रूप से हिलाएं और कम से कम 24 घंटे के लिए 5% कार्बन डाइऑक्साइड के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट को इनक्यूबेट करें। हर दिन माध्यम बदलें। एक बार जब क्लोन घनत्व 70% तक पहुंच जाता हैखर्च किए गए माध्यम को हटा दें।
2 डी पीबीएस washes के बाद, कमरे के तापमान पर चार से सात मिनट के लिए EDTA के एक मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को सेते हैं और EDTA पूरी तरह से त्यागें. कोशिकाओं के लिए रखरखाव माध्यम के एक मिलीलीटर जोड़ें और धीरे थाली नल. फिर एक 15 मिलीलीटर ट्यूब के लिए उखड़ा कोशिकाओं को स्थानांतरित और उन्हें तीन से पांच बार मिश्रण.
पहले से तैयार ईसीएम-लेपित डिश के प्रत्येक कुएं में सेल निलंबन के 20 से 100 माइक्रोलीटर जोड़ें और अच्छी तरह मिलाएं। माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, सेल घनत्व की पुष्टि करें और कोशिकाओं को 5% कार्बन डाइऑक्साइड के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।