culturing h9-embryonic stem cells for generation of human neural retina

Enhanced 3D Neural Retina Differentiation from Human Embryonic Stem Cells

The eye serves as the primary source of information among human sensory organs, with the retina being the principal visual sensory tissue in mammalian eyes1. Retinopathy stands as one of the primary global causes of eye diseases, leading to blindness2. Approximately 2.85 million people worldwide suffer from varying degrees of vision impairment due to retinopathy3. Consequently, investigating its pathogenesis is crucial for early diagnosis and timely treatment. Most studies on human retinopathy have primarily focused on animal models4,5,6. However, the human retina is a complex, multi-layered tissue comprising various cell types. Traditional two-dimensional (2D) cell culture and animal model systems typically fail to faithfully recapitulate the normal spatiotemporal development and drug metabolism of the native human retina7,8.
Recently, 3D culture techniques have evolved to generate tissue-like organs from pluripotent stem cells (PSCs)9,10. Retinal organoids (ROs) generated from human PSCs in a 3D suspension culture system not only contain seven retinal cell types but also exhibit a distinct stratified structure similar to the human retina in vivo11,12,13. Human PSC-derived ROs have gained popularity and widespread availability and are currently the best in vitro models for studying the development and disease of the human retina14,15. Over the past few decades, numerous researchers have demonstrated that human PSCs, including embryonic stem cells (ESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs), can differentiate into ROs using various induction protocols. These advancements hold enormous potential in retinopathy for disease modeling, drug screening, and stem cell-based therapies16,17,18.
However, the generation of neural retina (NR) from human pluripotent stem cells (PSCs) is a complex, cumbersome, and time-consuming process. Furthermore, batch-to-batch variations in tissue organoids may lead to lower reproducibility of results19,20. Numerous intrinsic and extrinsic factors can influence the yield of retinal organoids (ROs), such as the number or species of starting cells and the use of transcription factors and small-molecule compounds21,22,23. Since the first human RO was generated by the Sasai laboratory11, multiple modifications have been proposed over the years to enhance the ease and effectiveness of the induction process13,21,24,25. Unfortunately, to date, no gold standard protocol has been established for generating ROs in all laboratories. Indeed, there is a certain degree of discrepancy in ROs resulting from different induction methods, as well as wide variation in the expression of retinal markers and the robustness of their structure22,26. These issues may severely complicate sample collection and the interpretation of study findings. Therefore, a more consolidated and robust differentiation protocol is needed to maximize efficiency with minimal heterogeneity of RO generation.
This study describes an optimized induction protocol based on a combination of Kuwahara et al.12 and D&#246;pper et al.27 with detailed instructions. The new method significantly reduces the probability of organoid vesiculation and fusion, increasing the success rate of generating NR. This development holds great promise for disease modeling, drug screening, and cell therapy applications for retinal disorders.

Author Spotlight: Simple and Efficient Neural Retina Organoid Production for Disease Modeling

मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल से तंत्रिका रेटिना उत्पन्न करना

Our group focuses on understanding the pathogenesis and the treatment of human retinal diseases. Our protocol describes a optimized induction technique to generate a neural retina that significantly reduce the probability of vasculation and fusion to increase the success rate of retinal production until day 60. The modified method is simpler and more efficient in generating neural retina, which can prove to be a better disease model for drug screening and cell therapy.In the future, we aim to study the effects of physicochemical factors on retinal development and underlying mechanism using our retinal organoid model.

मानव तंत्रिका रेटिना की पीढ़ी के लिए H9-भ्रूण स्टेम सेल का संवर्धन 

शुरू करने के लिए, एक छह अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 1% बाह्य मैट्रिक्स के एक मिलीलीटर जोड़ें. एक 5% कार्बन डाइऑक्साइड वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं. एक घंटे के बाद, प्रत्येक कुएं में 0.4 माइक्रोमोलर Y-27632 युक्त प्रीवार्म रखरखाव माध्यम के दो मिलीलीटर जोड़ें।एच 9 भ्रूण स्टेम कोशिकाओं को पिघलाने के लिए, क्रायोवियल स्टॉक को 30 सेकंड के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में हिलाएं। क्रायोवियल को 75% कीटाणुनाशक अल्कोहल स्प्रे से सावधानीपूर्वक निष्फल करें। फिर पिघली हुई कोशिकाओं को रखरखाव माध्यम और Y-27632 युक्त 15 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें।कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए 190 ग्राम पर ट्यूब अपकेंद्रित्र. फिर ध्यान से सतह पर तैरनेवाला के सबसे हटा दें और Y-27632 युक्त रखरखाव माध्यम के एक मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें. रखरखाव माध्यम युक्त बाह्य मैट्रिक्स लेपित प्लेट के प्रत्येक कुएं के लिए सेल निलंबन के 0.5 मिलीलीटर बांटना।प्लेट को पार्श्व रूप से हिलाएं और कम से कम 24 घंटे के लिए 5% कार्बन डाइऑक्साइड के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट को इनक्यूबेट करें। हर दिन माध्यम बदलें। एक बार जब क्लोन घनत्व 70% तक पहुंच जाता हैखर्च किए गए माध्यम को हटा दें।2 डी पीबीएस washes के बाद, कमरे के तापमान पर चार से सात मिनट के लिए EDTA के एक मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को सेते हैं और EDTA पूरी तरह से त्यागें. कोशिकाओं के लिए रखरखाव माध्यम के एक मिलीलीटर जोड़ें और धीरे थाली नल. फिर एक 15 मिलीलीटर ट्यूब के लिए उखड़ा कोशिकाओं को स्थानांतरित और उन्हें तीन से पांच बार मिश्रण.पहले से तैयार ईसीएम-लेपित डिश के प्रत्येक कुएं में सेल निलंबन के 20 से 100 माइक्रोलीटर जोड़ें और अच्छी तरह मिलाएं। माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, सेल घनत्व की पुष्टि करें और कोशिकाओं को 5% कार्बन डाइऑक्साइड के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culturing H9-Embryonic Stem Cells for Generation of Human Neural Retina

Generating Neural Retina from Human Pluripotent Stem Cells

Retinopathy is one of the main causes of blindness worldwide. Investigating its pathogenesis is essential for the early diagnosis and timely treatment of ...

Inducing 3D Neural Retina Formation from Cultured H9-Embryonic Stem Cells for Stem-Cell Based Therapies

स्टेम सेल आधारित चिकित्सा के लिए सुसंस्कृत H9-भ्रूण स्टेम सेल से 3 डी तंत्रिका रेटिना गठन उत्प्रेरण