Name: Flow Cytometry Analysis of Cell-miRNA and EV-miRNA Signal in Calu6 Cells Transfected with Fluorophore-Conjugated EV-miRNA(Video)
Uploaded: 2023-10-06T12:00:00
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flow cytometry analysis of cell-mirna and ev-mirna signal in calu6 cells transfected with fluorophore-conjugated ev-mirna

Ein Durchflusszytometrie-Protokoll zum Verständnis von Exportmechanismen

MicroRNAs (miRNAs) are one of the best-characterized subsets of small noncoding RNAs, which are known for their critical role in post-transcriptional gene regulation. The expression and biogenesis of most miRNAs follow a coordinated series of events that begins with transcription of the primary miRNAs (pri-miRNAs) in the nucleus. Following nuclear processing by the microprocessor complex into precursor-miRNAs (pre-miRNAs), the pre-miRNAs are exported to the cytoplasm, where they undergo further processing by the RNase III endonuclease, dicer into 21-23 nucleotide mature miRNA duplexes1. One of the strands of the processed mature miRNA binds to target messenger RNAs (mRNAs), leading to degradation or translational repression of the targets2. Based on the pleiotropic role of miRNAs in simultaneously regulating multiple diverse target mRNAs, it is not surprising that miRNA expression is tightly regulated3. Indeed, inappropriate expression contributes to various disease states, especially in cancer. The aberrant expression of miRNAs not only represents a disease-specific signature but has also emerged as a target for prognostic and therapeutic potential4,5,6. In addition to their intracellular roles, miRNAs also have non-autonomous roles. For example, miRNAs can be selectively packaged into EVs by donor cells and exported to recipient sites where they elicit diverse phenotypic responses in normal and disease physiology7,8,9.
Despite clear evidence that EV-associated miRNAs are functional biomolecules, it is not completely understood how specific subsets of miRNAs are dysregulated in disease states such as cancer and how cellular machinery selects and sorts miRNAs into Evs10,11. Given the potential role of EV-miRNAs in modulating the microenvironment, it is critical to identify the mechanisms involved in the export of select miRNAs to fully elucidate the role of EVs in intercellular communication and disease pathogenesis. Understanding the process of miRNA release into EVs will not only highlight important mediators of miRNA export but can also provide insights into potential therapeutics. To achieve this level of knowledge, tools need to be adapted to faithfully address these new experimental questions. Indeed, studies that evaluate EVs are growing exponentially due to the introduction of new techniques and controls12,13. In relation to evaluating the abundance of exported miRNAs into EVs, next-generation sequencing and quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) have been the current standard tools. While these tools are useful for evaluating the abundance of miRNAs in EVs, there are limitations to their sensitivity and specificity, and using these static approaches for evaluating dynamics is insufficient. Delineating the dynamics of miRNA export into EVs requires a combination of specialized tools. Here, we present a comprehensive protocol using fluorescently conjugated miRNAs, to analyze the dynamics of miRNA release from donor cells and incorporation into EVs. We also discuss the advantages and limitations of the method and provide recommendations for optimal use. The versatile method presented in this paper will be useful to researchers interested in studying miRNA release into EVs and their potential roles in cellular communication and disease.

Autor im Rampenlicht: Erforschung der Mechanismen der microRNA-Beladung in extrazelluläre Vesikel bei der Krebsprogression 

Verfolgung der miRNA-Freisetzung in extrazelluläre Vesikel mittels Durchflusszytometrie

My lab works on studying microRNAs, and we have known for decades that microRNAs are depleted in cancer. However, the mechanism as to how these microRNAs are lost has not been actively understood. Our recent work on extracellular vesicles suggests that microRNA that are depleted in cancer are being actively loaded into these extracellular vesicles.Our goal now is to really get to the mechanism as to how these RNAs are actively loaded into these extracellular vesicles in the process of tumor genesis. The protocol helps understand and capture the dynamic process of microRNAs release into extracellular vesicles, which is one of the challenging areas in studying extracellular vesicle biology. Our findings provide a tool to advance the study of pathways that regulate depletion of microRNAs in cancer.We plan on identifying functional and phenotypic consequences of the loss of specific subsets of microRNA via extracellular vesicles in cancer. Once we identify the factors that are involved in loading these microRNAs into extracellular vesicles, our goal is to down-regulate these factors and evaluate the phenotypic consequence. Moreover, because we identified a motif that's contained in these small RNAs, we're curious to know whether this motif is both necessary and sufficient for loading these RNAs into the extracellular vesicles.

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Flow Cytometry Analysis of Cell-miRNA and EV-miRNA Signal in Calu6 Cells Transfected with Fluorophore-Conjugated EV-miRNA(Video) 

Durchflusszytometrische Analyse des Zell-miRNA- und EV-miRNA-Signals in Calu6-Zellen, die mit Fluorophor-konjugierter EV-miRNA transfiziert wurden

Nehmen Sie zunächst Calu6-Zellen, die mit Fluorophor-konjugierter EV-microRNA und Zell-microRNA transfiziert wurden. Filtern Sie die Zellsuspension durch eine 35-Mikrometer-Siebkappe, die im Lieferumfang der FACS-Röhrchen aus Polystyrol mit rundem Boden enthalten ist. Stellen Sie dann das Durchflusszytometriegerät auf, schalten Sie das Durchflusszytometer ein und lassen Sie es vor dem Gebrauch 30 Minuten lang aufwärmen.Grundieren Sie das fluidische System mit Mantelflüssigkeit. Überprüfen und justieren Sie anschließend die Laserausrichtung. Zur Qualitätskontrolle wird hochreines gefiltertes Wasser in das Durchflusszytometer geladen und mit einer geeigneten Durchflussrate betrieben, um eine angemessene Erfassungszeit zu gewährleisten.Stellen Sie dann den Schwellenwert für die Erfassung des Signals von Calu6-Zellen auf FSC 5.000 ein. Um die spektrale Überlappung zwischen den Fluorophoren zu berücksichtigen, werden Kompensationskontrollen mit nicht transfizierten Zellen und Zellen, die mit nur einem Fluorophor transfiziert wurden, hergestellt. Führen Sie eine Expressionsanalyse in transfizierten Zellen durch, indem Sie die FSC-, SSC-, FITC- und PE-Kanäle verwenden, die auf die Spannungseinheiten 258, 192, 269 bzw. 423 eingestellt sind.Anschließend wird die negative Kontrollprobe in das Durchflusszytometer eingeführt. Erfassen Sie Zellsignale, nachdem Sie FSC- und SSC-Intensitäten in einem benutzerdefinierten Arbeitsblatt definiert haben. Wählen Sie FSC für die X-Achse und SSC für die Y-Achse im Diagramm aus.Zeichnen Sie ein Polygon um die gewünschte Grundgesamtheit, um ein Tor auf der Achse zu erstellen. Um ein neues Diagramm mit der abgegrenzten Population zu erstellen, stellen Sie die X-Achse auf Fluoreszenzsignal 1 ein. Für die Zell-microRNA-Detektion und die Y-Achse zum Fluoreszenzsignal 2 für die EV-microRNA-Detektion.Festlegung von Kompensationsparametern für die einzelnen Fluorophore unter Verwendung von Zellen, die unabhängig voneinander mit jeder der fluoreszenzmarkierten microRNAs transfiziert wurden. Die durchflusszytometrische Analyse von Zellen, die mit Zell-microRNA und EV-microRNA transfiziert wurden, ergab eine sequentielle Abnahme des Fluoreszenzsignals, das der EV-microRNA entspricht. Im Gegensatz dazu wurde das Signal, das der Zell-microRNA entspricht, in den Zellen zurückgehalten, was darauf hindeutet, dass der Fluorophor die Retention von microRNAs durch die Zellen nicht beeinflusst.

Research

JoVE Journal

Biology

Flow Cytometry Analysis of Cell-miRNA and EV-miRNA Signal in Calu6 Cells Transfected with Fluorophore-Conjugated EV-miRNA

Tracking miRNA Release into Extracellular Vesicles using Flow Cytometry

Extracellular vesicles (EVs) are important mediators of cellular communication that are secreted by a variety of different cells. These EVs shuttle ...

Forschung

Biologie

Flow Cytometry Analysis of Cell-miRNA and EV-miRNA Signal in EVs Isolated from Calu6 Cells Transfected with Fluorophore-Conjugated EV-miRNA

Durchflusszytometrische Analyse des Zell-miRNA- und EV-miRNA-Signals in EVs, die aus Calu6-Zellen isoliert wurden, die mit Fluorophor-konjugierter EV-miRNA transfiziert wurden