Name: Durchflusszytometrische Analyse des Zell-miRNA- und EV-miRNA-Signals in EVs, die aus Calu6-Zellen isoliert wurden, die mit Fluorophor-konjugierter EV-miRNA transfiziert wurden
Uploaded: 2023-10-06T12:00:00
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flow cytometry analysis of cell-mirna and ev-mirna signal in evs isolated from calu6 cells transfected with fluorophore-conjugated ev-mirna

Ein Durchflusszytometrie-Protokoll zum Verständnis von Exportmechanismen

MicroRNAs (miRNAs) are one of the best-characterized subsets of small noncoding RNAs, which are known for their critical role in post-transcriptional gene regulation. The expression and biogenesis of most miRNAs follow a coordinated series of events that begins with transcription of the primary miRNAs (pri-miRNAs) in the nucleus. Following nuclear processing by the microprocessor complex into precursor-miRNAs (pre-miRNAs), the pre-miRNAs are exported to the cytoplasm, where they undergo further processing by the RNase III endonuclease, dicer into 21-23 nucleotide mature miRNA duplexes1. One of the strands of the processed mature miRNA binds to target messenger RNAs (mRNAs), leading to degradation or translational repression of the targets2. Based on the pleiotropic role of miRNAs in simultaneously regulating multiple diverse target mRNAs, it is not surprising that miRNA expression is tightly regulated3. Indeed, inappropriate expression contributes to various disease states, especially in cancer. The aberrant expression of miRNAs not only represents a disease-specific signature but has also emerged as a target for prognostic and therapeutic potential4,5,6. In addition to their intracellular roles, miRNAs also have non-autonomous roles. For example, miRNAs can be selectively packaged into EVs by donor cells and exported to recipient sites where they elicit diverse phenotypic responses in normal and disease physiology7,8,9.
Despite clear evidence that EV-associated miRNAs are functional biomolecules, it is not completely understood how specific subsets of miRNAs are dysregulated in disease states such as cancer and how cellular machinery selects and sorts miRNAs into Evs10,11. Given the potential role of EV-miRNAs in modulating the microenvironment, it is critical to identify the mechanisms involved in the export of select miRNAs to fully elucidate the role of EVs in intercellular communication and disease pathogenesis. Understanding the process of miRNA release into EVs will not only highlight important mediators of miRNA export but can also provide insights into potential therapeutics. To achieve this level of knowledge, tools need to be adapted to faithfully address these new experimental questions. Indeed, studies that evaluate EVs are growing exponentially due to the introduction of new techniques and controls12,13. In relation to evaluating the abundance of exported miRNAs into EVs, next-generation sequencing and quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) have been the current standard tools. While these tools are useful for evaluating the abundance of miRNAs in EVs, there are limitations to their sensitivity and specificity, and using these static approaches for evaluating dynamics is insufficient. Delineating the dynamics of miRNA export into EVs requires a combination of specialized tools. Here, we present a comprehensive protocol using fluorescently conjugated miRNAs, to analyze the dynamics of miRNA release from donor cells and incorporation into EVs. We also discuss the advantages and limitations of the method and provide recommendations for optimal use. The versatile method presented in this paper will be useful to researchers interested in studying miRNA release into EVs and their potential roles in cellular communication and disease.

Autor im Rampenlicht: Erforschung der Mechanismen der microRNA-Beladung in extrazelluläre Vesikel bei der Krebsprogression 

Verfolgung der miRNA-Freisetzung in extrazelluläre Vesikel mittels Durchflusszytometrie

My lab works on studying microRNAs, and we have known for decades that microRNAs are depleted in cancer. However, the mechanism as to how these microRNAs are lost has not been actively understood. Our recent work on extracellular vesicles suggests that microRNA that are depleted in cancer are being actively loaded into these extracellular vesicles.Our goal now is to really get to the mechanism as to how these RNAs are actively loaded into these extracellular vesicles in the process of tumor genesis. The protocol helps understand and capture the dynamic process of microRNAs release into extracellular vesicles, which is one of the challenging areas in studying extracellular vesicle biology. Our findings provide a tool to advance the study of pathways that regulate depletion of microRNAs in cancer.We plan on identifying functional and phenotypic consequences of the loss of specific subsets of microRNA via extracellular vesicles in cancer. Once we identify the factors that are involved in loading these microRNAs into extracellular vesicles, our goal is to down-regulate these factors and evaluate the phenotypic consequence. Moreover, because we identified a motif that's contained in these small RNAs, we're curious to know whether this motif is both necessary and sufficient for loading these RNAs into the extracellular vesicles.

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Durchflusszytometrische Analyse des Zell-miRNA- und EV-miRNA-Signals in EVs, die aus Calu6-Zellen isoliert wurden, die mit Fluorophor-konjugierter EV-miRNA transfiziert wurden

Nehmen Sie zunächst EVs, die aus Calu6-Zellen isoliert und mit Fluorophor-konjugierter EV-Mikro-RNA und Zell-Mikro-RNA transfiziert werden. Verdünnen Sie die EVs in einem geeigneten Volumen ultrafiltrierten PBS, um die extrazelluläre Vesikelsuspension für die Durchflusszytometrie-Analyse vorzubereiten. Verwenden Sie das Nano-Durchflusszytometer, um Partikel in Nanogröße zu analysieren.Starten Sie die Software und konfigurieren Sie das Gerät gemäß den empfohlenen Kalibrierungsanweisungen. Führen Sie den Leistungstest unter Verwendung von Leistungs-Nanoperlen durch. Die Leistung des Instruments gilt als optimal, wenn die Nanoperlen innerhalb des Standardgrößenbereichs detektiert werden.Bestimmen Sie die geeignete Durchflussrate für die EV-Partikeldetektion. Führen Sie nun eine Qualitätskontrolle mit hochreinem gefiltertem Wasser durch, um die Fluidik des Instruments zu überprüfen und die Leistung von Detektoren und Lasern zu bewerten. Konfigurieren Sie die Parameter, um die Empfindlichkeit und Auflösung verschiedener Populationen in der Perlenmischung gemäß dem Protokoll des Herstellers zu bewerten.Wenden Sie dann eine geeignete Anspritzung an, um die Perlenpopulation vom Instrumentenrauschen zu unterscheiden. Als Nächstes werden die Proben gründlich vorgewirbelt, um eine gleichmäßige Verteilung der Elektrofahrzeuge zu gewährleisten, bevor sie zur Analyse geladen werden. Starten Sie die Datenanalysesoftware für die Durchflusszytometrie und führen Sie ultrafiltriertes PBS ein.Richten Sie mithilfe von ultragefiltertem PBS ein Gating für EV-Partikel ein, um sicherzustellen, dass das Gating der entsprechenden Partikelgröße auf der Grundlage der Kalibrierung entspricht. Nehmen Sie EVs, die in eine abgestimmte kompatible Röhre übertragen und vortexed wurden, und laden Sie die Röhre in das Instrument. Erfassen Sie EV-Signale, während Sie FSC auf der x-Achse und SSC auf der y-Achse aufzeichnen.Wählen Sie für die Zell-Mikro-RNA-Detektion auf der x-Achse das Fluoreszenzsignal 1 und für die EV-Mikro-RNA-Detektion auf der y-Achse das Fluoreszenzsignal 2. Unter Verwendung der EV-Proben, die aus Zellen isoliert wurden, die mit einer einzigen Mikro-RNA transfiziert wurden. Etablierte Kompensationsparameter für die Fluorophore.Die Durchflusszytometrie ergab eine zeitabhängige Akkumulation von miR-451a, Alexa fluor-488 in Elektrofahrzeugen, was eine effiziente Verpackung und Freisetzung unterstützt. Im Gegensatz dazu wurde die Fluoreszenz der Zelle miR-67 in EVs nicht beobachtet.

Research

JoVE Journal

Biology

Flow Cytometry Analysis of Cell-miRNA and EV-miRNA Signal in EVs Isolated from Calu6 Cells Transfected with Fluorophore-Conjugated EV-miRNA

Tracking miRNA Release into Extracellular Vesicles using Flow Cytometry

Extracellular vesicles (EVs) are important mediators of cellular communication that are secreted by a variety of different cells. These EVs shuttle ...