Til at begynde med skal du sikre dig, at mikroskoplayoutet er forberedt på overfladen af det optiske bord med alle afstande nøjagtigt målt. Monter derefter excitationslaseren på bordet. Indstil to iris til laserens tilsigtede højde, og brug disse iris til at sikre, at strålen er plan og centreret.
Placer oversættelsesfasen, eller TS1, under placeringen af spejl 1 eller M1. Brug irisparret, der er indstillet til den nøjagtige højde, til at definere den ønskede udgangsstrålebane og styre placeringen og justeringen af hvert reflekterende element. Placer derefter M1 øverst på TS1. Monter og juster derefter dikroic over bordet.
På samme måde skal du montere galvoen og justere den med iriserne. Når justeringerne er foretaget, skal du placere M2 og derefter klemme M3 til bordet. Juster højden og positionen, indtil bjælken er nogenlunde centreret på begge matterede glasjusteringsskiver.
Tilføj derefter understøtninger til M3. Start derefter monteringsobjektiv 1 på bordet. Juster hældningen og sideværts position, indtil bjælken er centreret på de matterede glasplader over M3. Placer linse 2, og kontroller kollimationen ved hjælp af et spejl til at hoppe strålen på en fjern overflade.
Brug et indekskort eller et mål til at spore bjælken og sikre, at strålen ikke ændres i størrelse. Juster derefter x, y-positionen på pinhullet med XY-beslaget og den aksiale afstand med det endimensionelle trin for at maksimere transmissionen. Juster objektiv 4 aksialt for at fokusere excitationsstrålen på overfladen af galvoen, og arranger linse 3 på bordet efterfulgt af SL1.
Juster den aksiale afstand for SL1 for at danne et columeret teleskop med linse 4, og placer derefter TL1 parallelt med SL1. Juster højden på mål 1 på bursystemet, indtil bjælken danner en luftig skive i loftet. Og fortsæt derefter med at justere, indtil diskens størrelse er minimeret.
Det firkantede spejl anbringes på prøvetrinnet under mål 1, og spejlet justeres aksialt, indtil stråleprofilets størrelse minimeres efter dikroikken. Monter justeringslaseren ved at skubbe burstængerne ind i de tomme huller på de to burplader. Brug et kinematisk spejlbeslag og et rullespejl til at justere stierne for justerings- og excitationsstrålerne.
Det firkantede spejl anbringes aksialt på prøvetrinnet i mål 1 for at minimere stråleprofilen efter dikroikken. Indsæt SL2 og TL2 i emissionsvejen ved de respektive afstande. Juster XY-knapperne, og vip mål 2, så den røde justeringsstråle passerer gennem iris- og frostglasskiven.
Juster oversættelsestrin 2, indtil strålen danner en lille luftig skive på overfladen, og fortsæt derefter med at justere oversættelsestrin 2 for at minimere størrelsen på den luftige disk. For at optimere galvoen til hældning i variantscanning skal du trykke på FSK-knappen på bølgeformgeneratoren for at vælge et trekantbølgesignal til galvo og indstille det til en lav frekvens, såsom 1 hertz. Overhold justeringsbjælken på den samme overflade eller væg langt væk.
Monter mål 3 ca. 4-5 millimeter foran mål 2 i en 0 graders vinkel og juster højden, så den matcher. Placer en matteret glasjusteringsskive i det delte brændplan mellem SL2 og TL2 målt med en lineal. Når emissionslyset fylder O3's bagblændeåbning, skal du montere en matteret glasskive i kamerasensorens ru position og justere midten af disken til emissionslyset, der forlader O3. Placer TL3 bag mål 3, og juster hældningen for at justere det udgående lys med den matterede glasskive.
Placer kameraet i den målte afstand fra rørlinsen, og juster mål 3 aksialt fra buroversættelsestrinnet, indtil hullet er i fokus på kameraet. Juster mål 3 i en vinkel på 30 grader fra den optiske akse i mål 2 ved hjælp af linjerne på bordet som vejledning. Monter det positive gittertestmål igen i samme aksiale højde, og belys gitteret med det skarpe feltlys.
Fej fokusdelen af synsfeltet hen over skærmen vandret, mens gitterkvadraterne bevarer en ensartet størrelse. For at justere det skrå lysark skal du placere cylindriske linser eller CL, så strålen fokuseres i en vandret arkprofil ved fokusplanet på CL3. Indsæt og placer en slids i lodret retning på brændplanet mellem CL3 og objektiv 3.
Ved kamerasensoren skal du kontrollere, at 0 graders lysarket ser tyndt og lodret ud. Brug den motoriserede oversættelsestrinkontrol til at oversætte M1 mod de cylindriske linser for at vinkle lysarket. Indsæt den forberedte rhodamin mærket mikrotubuli testprøve på prøvetrinnet og juster den aksialt, så farvestoffet belyses af lyspladen i fem forskellige dybder mellem midten af synsfeltet og højre side af skærmen.
Gem derefter hvert billede. Åbn billederne i Fiji. For hvert billede tegner du ved hjælp af linjeværktøjet en vandret linje fra midten af synsfeltet til midten af lysarket.
Gå derefter til Analyser efterfulgt af Plot Profile for at beregne vinklen på lysarket over 01. Efter kalibrering af instrumentet skal du montere den forberedte tredimensionelle perleprøve og klikke på FSK-knappen på funktionsgeneratoren for at indstille en trekantbølge. For at finde prøven skal du bruge funktionsgeneratoren til at indstille parametrene startende fra 20 megahertz frekvens, 400 millivolt peak til peak amplitude og 0,4 forskydning.
Rul manuelt i Z, indtil prøveplanet er nået, og optimer Z-indstillingen. I micromanager-programmet skal du vælge en eksponeringstid og åbne vinduet med multidimensionel erhvervelse. Indstil intervallet til 30, og brug tællefeltet til at vælge antallet af billeder.
Når parametrene er indstillet, skal du registrere et tidsforløb for en fuld scanning af lydstyrken. De volumetriske scanninger af det rekonstituerede mikrotubulusnetværk viste, at de tredimensionelle strukturer voksede tæt mod midten, hvilket resulterede i lyse områder af fluorescens. I billedplaner nær dækselen opløste konfokalmikroskopi enkeltfilamenter omkring periferien af Astar med yderligere baggrund mod midten på grund af fluorescerende signaler ovenfra.
Men at flytte et par mikrometer i Z reducerede hurtigt kvaliteten af billederne på grund af de tætte sektioner af Astar, der var ude af fokus. Lysarkets enkeltplanbelysning eliminerede signalerne ude af fokus, hvilket muliggjorde sammenlignelig billedkvalitet mellem flyene.