Zorg er om te beginnen voor dat de lay-out van de microscoop op het oppervlak van de optische tafel is voorbereid en dat alle afstanden nauwkeurig zijn gemeten. Monteer vervolgens de excitatielaser op de tafel. Stel twee irissen in op de beoogde hoogte van de laser en gebruik deze irissen om ervoor te zorgen dat de straal waterpas en gecentreerd is.
Plaats de translatietrap, of TS1, onder de locatie van spiegel 1 of M1. Gebruik het paar irissen dat op de exacte hoogte is ingesteld om het gewenste pad van de uitgangsstraal te definiëren en de plaatsing en uitlijning van elk reflecterend element te begeleiden. Plaats vervolgens M1 aan de bovenkant van de TS1. Monteer en lijn vervolgens de dichroïsche over de tafel.
Monteer op dezelfde manier de galvo en lijn deze uit met de irissen. Zodra de uitlijning is gemaakt, plaatst u M2 en klemt u M3 op de tafel. Pas de hoogte en positie aan totdat de straal ongeveer gecentreerd is op beide matglazen uitlijnschijven.
Voeg dan steunen toe aan M3. Begin vervolgens met het monteren van lens 1 op de tafel. Pas de kanteling en zijdelingse positie aan totdat de balk gecentreerd is op de matglasplaten boven M3. Plaats lens 2 en controleer de collimatie door een spiegel te gebruiken om de straal op een ver weg oppervlak te laten weerkaatsen.
Gebruik een indexkaart of doel om de straal te traceren en zorg ervoor dat de straal niet van grootte verandert. Pas vervolgens de x-, y-positie van het gaatje aan met de XY-vatting en de axiale afstand met de eendimensionale tafel om de transmissie te maximaliseren. Pas lens 4 axiaal aan om de excitatiestraal op het oppervlak van de galvo te richten en plaats lens 3 op de tafel, gevolgd door SL1.
Pas de axiale afstand van SL1 aan om een gelumde telescoop met lens 4 te vormen en plaats vervolgens TL1 evenwijdig aan SL1. Pas de hoogte van objectief 1 op het kooisysteem aan totdat de balk een luchtige schijf aan het plafond vormt. En ga dan door met aanpassen totdat de grootte van de schijf is geminimaliseerd.
Plaats de vierkante spiegel op de monstertafel van objectief 1 en stel de spiegel axiaal af totdat de grootte van het straalprofiel na de dichroïsche film is geminimaliseerd. Monteer de uitlijnlaser door de kooistangen in de lege gaten van de twee kooiplaten te schuiven. Gebruik een kinematische spiegelbevestiging en een neerklapbare spiegel om de paden van de uitlijnings- en excitatiestralen uit te lijnen.
Plaats de vierkante spiegel axiaal op de monstertafel van objectief 1 om het straalprofiel na de dichroïsche te minimaliseren. Plaats SL2 en TL2 in het emissiepad op de respectievelijke afstanden. Stel de XY-knoppen en kanteling van objectief 2 zo af dat de rode uitlijnstraal door de iris en de matglazen schijf gaat.
Pas de translatiefase 2 aan totdat de straal een kleine luchtige schijf op het oppervlak vormt en ga dan verder met het aanpassen van de translatiefase 2 om de grootte van de luchtige schijf te minimaliseren. Om de galvo te optimaliseren voor kantelen in variantscanning, drukt u op de FSK-knop op de golfvormgenerator om een driehoeksgolfsignaal voor de galvo te selecteren en deze in te stellen op een lage frequentie, zoals 1 hertz. Let op de uitlijningsstraal op hetzelfde verre oppervlak of dezelfde muur.
Monteer objectief 3 ongeveer 4-5 millimeter voor objectief 2 in een hoek van 0 graden en pas de hoogte daarop aan. Plaats een matglazen uitlijnschijf in het gedeelde brandpuntsvlak tussen SL2 en TL2, gemeten met een liniaal. Zodra het emissielicht de achterste opening van O3 vult, monteert u een matglazen schijf in de ruwe positie van de camerasensor en lijnt u het midden van de schijf uit met het emissielicht dat O3 verlaat. Plaats TL3 achter objectief 3 en pas de kanteling aan om het uitgaande licht uit te lijnen met de matglazen schijf.
Plaats de camera op de gemeten afstand van de buislens en pas objectief 3 axiaal aan vanaf de translatiefase van de kooi totdat het gat scherp is op de camera. Stel objectief 3 opnieuw af in een hoek van 30 graden ten opzichte van de optische as van objectief 2 met behulp van de lijnen op de tafel als richtlijn. Monteer het positieve rastertestdoel weer op dezelfde ashoogte en verlicht het rooster met het heldere veldlicht.
Veeg het scherpgestelde gedeelte van het gezichtsveld horizontaal over het scherm terwijl de rastervierkanten een uniforme grootte behouden. Om de schuine lichtplaat uit te lijnen, plaatst u cilindrische lenzen of CL, zodat de straal wordt gefocusseerd in een horizontaal plaatprofiel op het brandpuntsvlak van CL3. Plaats en plaats een gleuf in de verticale oriëntatie op het brandpuntsvlak tussen CL3 en lens 3.
Controleer bij de camerasensor of de lichtplaat van 0 graden dun en verticaal lijkt. Gebruik de gemotoriseerde translatiefaseregeling om M1 in de richting van de cilindrische lenzen te vertalen om de lichtplaat in een hoek te plaatsen. Plaats het vooraf voorbereide met rhodamine gelabelde microtubuli-testmonster op de monstertafel en pas het axiaal aan zodat de kleurstof wordt verlicht door de lichtplaat op vijf verschillende diepten tussen het midden van het gezichtsveld en de rechterkant van het scherm.
Sla vervolgens elke afbeelding op. Open de afbeeldingen in Fiji. Teken voor elke afbeelding met het gereedschap Lijn een horizontale lijn van het midden van het gezichtsveld naar het midden van het lichtvel.
Ga dan naar Analyseren, gevolgd door Plotprofiel om de hoek van de lichtplaat boven 01 te berekenen. Monteer na het kalibreren van het instrument het vooraf voorbereide driedimensionale parelmonster en klik op de FSK-knop op de functiegenerator om een driehoeksgolf in te stellen. Om het monster te vinden, gebruikt u de functiegenerator om de parameters in te stellen vanaf een frequentie van 20 megahertz, een piekamplitude van 400 millivolt en een offset van 0,4.
Scroll handmatig in Z totdat het samplevlak is bereikt en optimaliseer de Z-instelling. Selecteer in het micromanager-programma een belichtingstijd en open het multidimensionale acquisitievenster. Stel het interval in op 30 en gebruik het telvak om het aantal frames te kiezen.
Zodra de parameters zijn ingesteld, neemt u een time-lapse op voor een volledige scan van het volume. De volumetrische scans van het gereconstitueerde microtubuli-netwerk toonden aan dat de driedimensionale structuren dicht naar het centrum groeiden, wat resulteerde in heldere fluorescentiegebieden. In beeldvormingsvlakken in de buurt van de dekglaas, loste confocale microscopie enkele filamenten rond de periferie van de Astar op met extra achtergrond naar het centrum als gevolg van onscherpe fluorescerende signalen van bovenaf.
Het verplaatsen van een paar micron in Z verminderde echter snel de kwaliteit van de beelden vanwege de onscherpe dichte delen van de Astar. De enkelvlaksverlichting van de lichtplaat elimineerde de onscherpe signalen, waardoor een vergelijkbare beeldkwaliteit tussen de vlakken mogelijk was.