Stellen Sie zunächst sicher, dass das Mikroskoplayout auf der Oberfläche des optischen Tisches vorbereitet ist und alle Abstände genau gemessen werden. Montieren Sie dann den Anregungslaser auf dem Tisch. Stellen Sie zwei Iris auf die vorgesehene Höhe des Lasers ein und verwenden Sie diese Iris, um sicherzustellen, dass der Strahl waagerecht und zentriert ist.
Positionieren Sie den Verschiebungstisch (TS1) unter der Position von Spiegel 1 oder M1. Verwenden Sie das auf die exakte Höhe eingestellte Irispaar, um den gewünschten Austrittsstrahlengang zu definieren und die Platzierung und Ausrichtung jedes reflektierenden Elements zu steuern. Positionieren Sie als Nächstes M1 oben auf dem TS1. Montieren Sie dann den dichroitischen Tisch und richten Sie ihn über dem Tisch aus.
Montieren Sie auf ähnliche Weise den Galvo und richten Sie ihn an der Iris aus. Sobald die Ausrichtungen vorgenommen sind, positionieren Sie M2 und klemmen Sie M3 an den Tisch. Passen Sie die Höhe und Position an, bis der Strahl ungefähr auf beiden Milchglas-Ausrichtungsscheiben zentriert ist.
Fügen Sie dann Stützen zu M3 hinzu. Beginnen Sie als Nächstes mit der Montage von Linse 1 auf dem Tisch. Stellen Sie die Neigung und die seitliche Position ein, bis der Strahl auf den Milchglasplatten über M3 zentriert ist. Positionieren Sie Linse 2 und überprüfen Sie die Kollimation, indem Sie den Strahl mit einem Spiegel auf eine weit entfernte Oberfläche reflektieren.
Verwenden Sie eine Karteikarte oder ein Ziel, um den Strahl nachzuzeichnen, und stellen Sie sicher, dass sich die Größe des Strahls nicht ändert. Passen Sie dann die x-, y-Position der Lochblende mit der XY-Halterung und den axialen Abstand mit dem eindimensionalen Tisch an, um die Übertragung zu maximieren. Stellen Sie die Linse 4 axial ein, um den Anregungsstrahl auf die Oberfläche des Galvo zu fokussieren, und ordnen Sie die Linse 3 auf dem Tisch an, gefolgt von SL1.
Stellen Sie den Achsabstand von SL1 so ein, dass ein gefaltetes Teleskop mit Linse 4 entsteht, und positionieren Sie dann TL1 parallel zu SL1. Stellen Sie die Höhe von Objektiv 1 am Käfigsystem ein, bis der Balken eine luftige Scheibe an der Decke bildet. Und dann weiter einstellen, bis die Größe der Disc minimiert ist.
Platzieren Sie den quadratischen Spiegel auf dem Probentisch von Objektiv 1 und justieren Sie den Spiegel axial, bis die Größe des Strahlprofils nach dem dichroitischen minimiert ist. Montieren Sie den Ausrichtungslaser, indem Sie die Käfigstangen in die leeren Löcher der beiden Käfigplatten schieben. Verwenden Sie eine kinematische Spiegelhalterung und einen Dropdown-Spiegel, um die Pfade der Ausrichtungs- und Anregungsstrahlen auszurichten.
Positionieren Sie den quadratischen Spiegel axial auf dem Probentisch von Objektiv 1, um das Strahlprofil nach dem dichroitischen zu minimieren. Fügen Sie SL2 und TL2 in den jeweiligen Abstand in den Emissionspfad ein. Stellen Sie die XY-Knöpfe und die Neigung von Objektiv 2 so ein, dass der rote Ausrichtungsstrahl durch die Iris und die Milchglasscheibe geht.
Passen Sie die Translationsstufe 2 an, bis der Balken eine kleine luftige Scheibe auf der Oberfläche bildet, und stellen Sie dann die Translationsstufe 2 weiter ein, um die Größe der luftigen Scheibe zu minimieren. Um den Galvo für die Neigung beim Variantenscannen zu optimieren, drücken Sie die FSK-Taste am Wellenformgenerator, um ein Dreieckswellensignal für den Galvo auszuwählen, und stellen Sie es auf eine niedrige Frequenz ein, z. B. 1 Hertz. Beobachten Sie den Ausrichtungsstrahl auf derselben weit entfernten Oberfläche oder Wand.
Montieren Sie Objektiv 3 etwa 4-5 Millimeter vor Objektiv 2 in einem Winkel von 0 Grad und passen Sie die Höhe entsprechend an. Positionieren Sie eine Milchglas-Ausrichtungsscheibe in der gemeinsamen Brennebene zwischen SL2 und TL2, gemessen mit einem Lineal. Sobald das Emissionslicht die hintere Öffnung von O3 ausfüllt, montieren Sie eine Milchglasscheibe in der groben Position des Kamerasensors und richten Sie die Mitte der Scheibe auf das aus O3 austretende Emissionslicht aus. Positionieren Sie TL3 hinter Objektiv 3 und stellen Sie die Neigung ein, um das austretende Licht auf die Milchglasscheibe auszurichten.
Platzieren Sie die Kamera im gemessenen Abstand vom Tubusobjektiv und stellen Sie Objektiv 3 axial vom Käfigverschiebetisch aus, bis das Loch auf der Kamera scharf ist. Stellen Sie Objektiv 3 in einem Winkel von 30 Grad von der optischen Achse von Objektiv 2 aus neu ein, indem Sie die Linien auf dem Tisch als Richtlinie verwenden. Montieren Sie das positive Gittertesttarget wieder auf der gleichen axialen Höhe und beleuchten Sie das Gitter mit dem Hellfeldlicht.
Streichen Sie den fokussierten Teil des Sichtfelds horizontal über den Bildschirm, während die Rasterquadrate eine einheitliche Größe beibehalten. Um das schräge Lichtblatt auszurichten, positionieren Sie zylindrische Linsen oder CL so, dass der Strahl in der Brennebene von CL3 in ein horizontales Blattprofil fokussiert wird. Setzen Sie einen Schlitz in vertikaler Ausrichtung in der Brennebene zwischen CL3 und Linse 3 ein und positionieren Sie ihn.
Vergewissern Sie sich am Kamerasensor, dass das 0-Grad-Lichtblatt dünn und vertikal erscheint. Verschieben Sie M1 mit der motorisierten Verschiebungstischsteuerung in Richtung der Zylinderlinsen, um das Lichtblatt zu winkeln. Legen Sie die vorbereitete mit Rhodamin markierte Mikrotubuli-Testprobe auf den Probentisch und stellen Sie sie axial so ein, dass der Farbstoff von der Lichtfolie in fünf verschiedenen Tiefen zwischen der Mitte des Sichtfelds und der rechten Seite des Bildschirms beleuchtet wird.
Speichern Sie dann jedes Bild. Öffnen Sie die Bilder in Fidschi. Zeichnen Sie für jedes Bild mit dem Linienwerkzeug eine horizontale Linie von der Mitte des Sichtfelds zur Mitte des Lichtblatts.
Gehen Sie dann zu Analysieren, gefolgt von Diagrammprofil, um den Winkel des Lichtblatts über 01 zu berechnen. Montieren Sie nach der Kalibrierung des Geräts die vorbereitete dreidimensionale Perlenprobe und klicken Sie auf die FSK-Taste am Funktionsgenerator, um eine Dreieckswelle einzustellen. Um das Sample zu finden, verwenden Sie den Funktionsgenerator, um die Parameter ab 20 Megahertz Frequenz, 400 Millivolt Peak-to-Peak-Amplitude und 0,4 Offset einzustellen.
Scrollen Sie manuell in Z, bis die Sample-Ebene erreicht ist, und optimieren Sie die Z-Einstellung. Wählen Sie im Mikromanager-Programm eine Belichtungszeit aus und öffnen Sie das mehrdimensionale Aufnahmefenster. Stellen Sie das Intervall auf 30 ein und verwenden Sie das Zählfeld, um die Anzahl der Frames auszuwählen.
Sobald die Parameter eingestellt sind, nehmen Sie einen Zeitraffer für einen vollständigen Scan des Volumes auf. Die volumetrischen Scans des rekonstituierten Mikrotubuli-Netzwerks zeigten, dass die dreidimensionalen Strukturen zum Zentrum hin dicht wurden, was zu hellen Fluoreszenzbereichen führte. In Bildebenen in der Nähe des Deckglases löste die konfokale Mikroskopie einzelne Filamente um die Peripherie des Astar herum auf, mit zusätzlichem Hintergrund in Richtung Zentrum aufgrund unscharfer Fluoreszenzsignale von oben.
Das Verschieben einiger Mikrometer in Z verringerte jedoch schnell die Qualität der Bilder aufgrund der unscharfen, dichten Abschnitte des Astar. Die Einzelebenenbeleuchtung des Lichtblatts eliminierte die unscharfen Signale und ermöglichte eine vergleichbare Bildqualität zwischen den Ebenen.
