시작하려면 모든 거리가 정확하게 측정된 광학 테이블 표면에 현미경 레이아웃이 준비되었는지 확인하십시오. 그런 다음 여기 레이저를 테이블에 장착합니다. 두 개의 조리개를 레이저의 의도된 높이로 설정하고 이 조리개를 사용하여 빔이 수평을 이루고 중앙에 위치하도록 합니다.
평행 이동 스테이지 또는 TS1을 미러 1 또는 M1의 위치 아래에 배치합니다. 정확한 높이로 설정된 조리개 쌍을 사용하여 원하는 출구 빔 경로를 정의하고 각 반사 요소의 배치 및 정렬을 안내합니다. 그런 다음 M1을 TS1 상단에 위치시킵니다. 그런 다음 이색성을 테이블 위에 장착하고 정렬합니다.
마찬가지로 갈보를 장착하고 홍채와 정렬합니다. 정렬이 완료되면 M2를 배치한 다음 clamp M3을 테이블에 연결합니다. 빔이 두 젖빛 유리 정렬 디스크의 대략 중앙에 올 때까지 높이와 위치를 조정합니다.
그런 다음 M3에 지지대를 추가합니다. 다음으로 테이블에 렌즈 1을 장착하기 시작합니다. 빔이 M3 위의 젖빛 유리판의 중앙에 올 때까지 기울기 및 측면 위치를 조정합니다. 렌즈 2를 배치하고 거울을 사용하여 빔을 멀리 떨어진 표면에 반사시켜 시준을 확인합니다.
인덱스 카드 또는 타겟을 사용하여 빔을 추적하고 빔의 크기가 변하지 않는지 확인합니다. 그런 다음 XY 마운트로 핀홀의 x, y 위치를 조정하고 1차원 스테이지로 축 거리를 조정하여 투과율을 최대화합니다. 렌즈 4를 축 방향으로 조정하여 여기 빔을 갈보 표면에 초점을 맞추고 렌즈 3을 테이블 위에 배치한 다음 SL1을 정렬합니다.
SL1의 축 거리를 조정하여 렌즈 4가 있는 콜루메이티드 망원경을 형성한 다음 TL1을 SL1과 평행하게 배치합니다. 빔이 천장에 통풍이 잘되는 디스크를 형성할 때까지 케이지 시스템에서 목표 1의 높이를 조정합니다. 그런 다음 디스크 크기가 최소화될 때까지 계속 조정합니다.
대물렌즈 1의 샘플 스테이지에 사각 미러를 놓고 이색성 이후 빔 프로파일의 크기가 최소화될 때까지 미러를 축 방향으로 조정합니다. 케이지 로드를 두 케이지 플레이트의 빈 구멍에 밀어 넣어 정렬 레이저를 장착합니다. 하나의 Kinematic mirror 마운트와 하나의 드롭다운 미러를 사용하여 정렬 및 여기 빔의 경로를 정렬합니다.
사각 거울을 objective 1의 샘플 스테이지에 축 방향으로 배치하여 이색성 이후의 빔 프로파일을 최소화합니다. SL2 및 TL2를 해당 거리의 방출 경로에 삽입합니다. 빨간색 정렬 빔이 조리개와 젖빛 유리 디스크를 통과하도록 XY 노브와 대물렌즈 2의 기울기를 조정합니다.
빔이 표면에 작은 통풍 원반을 형성할 때까지 병진 단계 2를 조정한 다음 병동 원반의 크기를 최소화하기 위해 이동 단계 2를 계속 조정합니다. 변형 스캐닝에서 기울기에 대한 갈보를 최적화하려면 파형 발생기의 FSK 버튼을 눌러 갈보에 대한 삼각파 신호를 선택하고 1Hz와 같은 저주파로 설정하십시오. 동일한 먼 표면이나 벽에서 정렬 빔을 관찰하십시오.
대물렌즈 3을 대물렌즈 2 앞에 약 4-5mm 각도로 0도 각도로 장착하고 그에 맞게 높이를 조정합니다. 눈금자로 측정한 대로 SL2와 TL2 사이의 공유 초점면에 반투명 유리 정렬 디스크를 놓습니다. 방출광이 O3의 후면 조리개를 채우면 카메라 센서의 거친 위치에 젖빛 유리 디스크를 장착하고 디스크 중앙을 O3에서 나오는 방출광에 맞춥니다. TL3을 대물렌즈 3 뒤에 배치하고 기울기를 조정하여 나가는 조명을 반투명 유리 디스크에 맞춥니다.
튜브 렌즈에서 측정된 거리에 카메라를 놓고 구멍이 카메라에 초점이 맞춰질 때까지 케이지 변환 단계에서 대물렌즈 3을 축 방향으로 조정합니다. 테이블의 선을 가이드로 사용하여 objective 2의 광축에서 30도 각도로 objective 3을 재조정합니다. 포지티브 그리드 테스트 타겟을 동일한 축 높이에 다시 장착하고 명시야 조명으로 그리드를 비춥니다.
격자 사각형이 균일한 크기를 유지하면서 화면을 가로질러 시야의 초점이 맞춰진 부분을 가로로 스윕합니다. 비스듬한 광시트를 정렬하려면 원통형 렌즈 또는 CL을 배치하여 빔이 CL3의 초점면에서 수평 시트 프로파일에 초점을 맞추도록 합니다. CL3과 렌즈 3 사이의 초점면에 수직 방향으로 슬릿을 삽입하고 배치합니다.
카메라 센서에서 0도 광시트가 얇고 수직으로 나타나는지 확인합니다. 전동식 번역 스테이지 컨트롤을 사용하여 M1을 원통형 렌즈 쪽으로 이동하여 광시트의 각도를 조정합니다. 미리 준비된 로다민으로 표지된 미세소관 테스트 샘플을 샘플 스테이지에 삽입하고 시야 중앙과 화면 오른쪽 사이의 5가지 다른 깊이에서 라이트 시트에 의해 염료가 조명되도록 축 방향으로 조정합니다.
그런 다음 각 이미지를 저장합니다. 피지에서 이미지를 엽니다. 각 이미지에 대해 [선 도구]를 사용하여 시야의 중심에서 광시트의 중심까지 수평선을 그립니다.
그런 다음 분석으로 이동한 다음 플롯 프로파일로 이동하여 01 이상의 광시트 각도를 계산합니다. 기기를 교정한 후 미리 준비된 3차원 비드 샘플을 장착하고 함수 발생기의 FSK 버튼을 클릭하여 삼각파를 설정합니다. 샘플을 찾으려면 함수 생성기를 사용하여 20메가헤르츠 주파수, 400밀리볼트 피크-피크 진폭, 0.4오프셋에서 시작하는 파라미터를 설정합니다.
샘플 평면에 도달할 때까지 Z를 수동으로 스크롤하고 Z 설정을 최적화합니다. 마이크로 매니저 프로그램에서 노출 시간을 선택하고 다차원 획득 창을 엽니다. 간격을 30으로 설정하고 개수 상자를 사용하여 프레임 수를 선택합니다.
매개변수가 설정되면 볼륨의 전체 스캔을 한 번 위해 타임랩스를 기록합니다. 재구성 된 미세소관 네트워크의 체적 스캔은 3 차원 구조가 중앙으로 갈수록 조밀 해져서 밝은 형광 영역이 생성되었음을 보여주었습니다. 커버 슬립 근처의 이미징 평면에서 컨포칼 현미경은 위에서 초점이 맞지 않는 형광 신호로 인해 중심을 향한 추가 배경과 함께 Astar 주변 주변의 단일 필라멘트를 분해했습니다.
그러나 Z에서 몇 미크론을 움직이면 Astar의 초점이 맞지 않는 조밀한 부분으로 인해 이미지 품질이 빠르게 저하되었습니다. 라이트 시트의 단일 평면 조명은 초점이 맞지 않는 신호를 제거하여 평면 간에 유사한 이미지 품질을 제공합니다.
