For å begynne, sørg for at mikroskopoppsettet er forberedt på overflaten av det optiske bordet med alle avstandene nøyaktig målt. Monter deretter eksitasjonslaseren på bordet. Sett to iriser til den tiltenkte høyden på laseren, og bruk disse irisene for å sikre at strålen er jevn og sentrert.
Plasser oversettelsestrinnet, eller TS1, under plasseringen av speil 1 eller M1. Bruk irisparet satt til nøyaktig høyde for å definere ønsket utgangsstrålebane og veilede plasseringen og justeringen av hvert reflekterende element. Deretter plasserer du M1 øverst på TS1. Monter og juster deretter dikroikken over bordet.
På samme måte monterer du galvoen og justerer den med irisene. Når justeringene er gjort, plasserer du M2 og klemmer M3 til bordet. Juster høyden og posisjonen til strålen er omtrent sentrert på begge frostede glassjusteringsskiver.
Legg til støtter til M3 da. Deretter begynner du å montere objektiv 1 på bordet. Juster vippe- og sideposisjonen til strålen er sentrert på de frostede glassplatene over M3. Plasser linse 2 og kontroller kollimasjonen ved å bruke et speil til å sprette strålen på en overflate langt unna.
Bruk et indekskort eller mål for å spore strålen og sørg for at strålen ikke endres i størrelse. Juster deretter x, y-posisjonen til pinhole med XY-festet og aksialavstanden med det endimensjonale trinnet for å maksimere overføringen. Juster linse 4 aksialt for å fokusere eksitasjonsstrålen på overflaten av galvoen og ordne linse 3 på bordet, etterfulgt av SL1.
Juster den aksiale avstanden til SL1 for å danne et kolumert teleskop med linse 4, og plasser deretter TL1 parallelt med SL1. Juster høyden på mål 1 på merdsystemet til strålen danner en luftig skive i taket. Og fortsett deretter å justere til størrelsen på platen er minimert.
Plasser det firkantede speilet på prøvetrinnet i mål 1 og juster speilet aksialt til størrelsen på stråleprofilen er minimert etter dikroisk. Monter justeringslaseren ved å skyve burstengene inn i de tomme hullene på de to burplatene. Bruk ett kinematisk speilfeste og ett rullegardinspeil for å justere banene til justerings- og eksitasjonsbjelkene.
Plasser det firkantede speilet aksialt på prøvetrinnet til mål 1 for å minimere stråleprofilen etter dikroikum. Sett inn SL2 og TL2 i utslippsbanen på de respektive avstandene. Juster XY-knappene og vippingen på mål 2 slik at den røde justeringsstrålen passerer gjennom iris og frostet glassplate.
Juster oversettelsestrinn 2 til strålen danner en liten, luftig skive på overflaten, og fortsett deretter justeringen av trinn 2 for å minimere størrelsen på den luftige skiven. For å optimalisere galvoen for tilt i variantskanning, trykk på FSK-knappen på bølgeformgeneratoren for å velge et trekantbølgesignal for galvoen og sett den til en lav frekvens, for eksempel 1 hertz. Vær oppmerksom på justeringsstrålen på samme overflate eller vegg langt unna.
Monter mål 3 ca 4-5 millimeter foran mål 2 i en 0 graders vinkel og juster høyden for å matche. Plasser en frostet glassjusteringsskive i det delte fokalplanet mellom SL2 og TL2 målt med en linjal. Når utslippslyset fyller den bakre blenderåpningen til O3, monter en frostet glassplate i den grove posisjonen til kamerasensoren og juster midten av platen til utslippslyset som går ut av O3. Plasser TL3 bak mål 3 og juster vippingen for å justere det utgående lyset med den frostede glassplaten.
Plasser kameraet på den målte avstanden fra rørlinsen og juster mål 3 aksialt fra burets oversettelsestrinn til hullet er i fokus på kameraet. Juster mål 3 i en 30 graders vinkel fra den optiske aksen til mål 2 ved å bruke linjene på bordet som veiledning. Monter det positive rutenetttestmålet på nytt i samme aksiale høyde og lys opp rutenettet med det sterke feltlyset.
Sveip den fokuserte delen av synsfeltet over skjermen horisontalt, mens rutenettrutene beholder en jevn størrelse. For å justere det skrå lysarket, plasser sylindriske linser, eller CL, slik at strålen fokuseres inn i en horisontal arkprofil ved fokalplanet til CL3. Sett inn og plasser en spalt i vertikal retning i fokalplanet mellom CL3 og objektiv 3.
Bekreft at 0-graders lysarket vises tynt og vertikalt på kamerasensoren. Bruk den motoriserte oversettelsestrinnskontrollen til å oversette M1 mot de sylindriske linsene for å vinkle lysarket. Sett den ferdigforberedte rhodamin-merkede mikrotubuli-testprøven inn på prøvetrinnet og juster den aksialt slik at fargestoffet belyses av lysarket i fem forskjellige dybder mellom sentrum av synsfeltet og høyre side av skjermen.
Lagre deretter hvert bilde. Åpne bildene på Fiji. For hvert bilde tegner du en horisontal linje fra midten av synsfeltet til midten av lysarket ved hjelp av linjeverktøyet.
Gå deretter til Analyser, etterfulgt av Plot Profile for å beregne vinkelen på lysarket over 01. Etter kalibrering av instrumentet, monter den forhåndsforberedte tredimensjonale perleprøven og klikk på FSK-knappen på funksjonsgeneratoren for å stille inn en trekantbølge. For å finne prøven, bruk funksjonsgeneratoren til å stille parametrene fra 20 megahertz-frekvens, 400 millivolt topp til toppamplitude og 0,4 forskyvning.
Rull i Z manuelt til prøveplanet er nådd, og optimaliser Z-innstillingen. I mikromanagerprogrammet velger du en eksponeringstid og åpner det flerdimensjonale innsamlingsvinduet. Sett intervallet til 30 og bruk telleboksen til å velge antall bilder.
Når parametrene er angitt, registrerer du en tidsforløp for en fullstendig skanning av volumet. De volumetriske skanningene av det rekonstituerte mikrotubulinettverket viste at de tredimensjonale strukturene vokste tett mot sentrum, noe som resulterte i lyse områder av fluorescens. I avbildningsplan nær dekselslippet løste konfokalmikroskopi enkeltfilamenter rundt periferien av Astar med ekstra bakgrunn mot sentrum på grunn av ufokuserte fluorescerende signaler ovenfra.
Å flytte noen mikrometer i Z reduserte imidlertid raskt kvaliteten på bildene på grunn av de ufokuserte tette delene av Astar. Enkeltplanbelysningen av lysarket eliminerte signalene ute av fokus, noe som muliggjorde sammenlignbar bildekvalitet mellom flyene.