Для начала убедитесь, что макет микроскопа подготовлен на поверхности оптического стола с точным измерением всех расстояний. Затем установите возбуждающий лазер на стол. Установите две радужки на предполагаемую высоту лазера и используйте эти радужки, чтобы убедиться, что луч выровнен и отцентрирован.
Расположите ступень преобразования, или TS1, под зеркалом 1 или M1. Используйте пару радужных оболочек, установленных на точную высоту, чтобы определить желаемую траекторию выходной балки и определить размещение и выравнивание каждого отражающего элемента. Затем расположите M1 в верхней части TS1. Затем установите и выровняйте дихроика над столом.
Точно так же закрепите гальво и совместите его с ирисами. После того, как выравнивание будет выполнено, расположите M2, затем прижмите M3 к столу. Отрегулируйте высоту и положение до тех пор, пока луч не будет примерно отцентрирован на обоих выравнивающих дисках из матового стекла.
Затем добавьте опоры на M3. Далее приступаем к креплению объектива 1 на столе. Отрегулируйте наклон и боковое положение до тех пор, пока луч не окажется по центру на пластинах из матового стекла над M3. Расположите линзу 2 и проверьте коллимацию с помощью зеркала, чтобы отразить луч на удаленную поверхность.
Используйте каталожную карточку или мишень для трассировки луча и убедитесь, что балка не изменится в размере. Затем отрегулируйте положение отверстия по осям X и Y с помощью крепления XY и осевое расстояние с одномерным столиком, чтобы максимизировать передачу. Отрегулируйте линзу 4 в осевом направлении, чтобы сфокусировать луч возбуждения на поверхности гальво, и расположите линзу 3 на столе, а затем SL1.
Отрегулируйте осевое расстояние SL1, чтобы сформировать колюмированный телескоп с линзой 4, затем расположите TL1 параллельно SL1. Отрегулируйте высоту объектива 1 на системе клеток до тех пор, пока балка не образует воздушный диск на потолке. А затем продолжайте регулировку до тех пор, пока размер диска не будет сведен к минимуму.
Поместите квадратное зеркало на образец предмета 1 и отрегулируйте зеркало в осевом направлении до тех пор, пока размер профиля луча не будет сведен к минимуму после дихроичности. Установите юстировочный лазер, вставив стержни сепаратора в пустые отверстия двух пластин сепаратора. Используйте одно кинематическое зеркальное крепление и одно раскрывающееся зеркало для выравнивания траекторий юстировочных и возбуждающих лучей.
Расположите квадратное зеркало в осевом направлении на предмете образца объектива 1, чтобы свести к минимуму профиль луча после дихроичности. Вставьте SL2 и TL2 в тракт излучения на соответствующих расстояниях. Отрегулируйте ручки XY и наклон объектива 2 таким образом, чтобы красный юстировочный луч проходил через диафрагму и диск из матового стекла.
Отрегулируйте ступень перемещения 2 до тех пор, пока луч не образует небольшой воздушный диск на поверхности, а затем продолжайте регулировку ступени трансляции 2, чтобы свести к минимуму размер воздушного диска. Чтобы оптимизировать гальваниз для наклона при вариантном сканировании, нажмите кнопку FSK на генераторе сигналов, чтобы выбрать сигнал треугольной волны для гальвана и установить его на низкую частоту, например 1 герц. Наблюдайте за выравнивающим лучом на той же удаленной поверхности или стене.
Установите объектив 3 примерно на 4-5 миллиметров перед объективом 2 под углом 0 градусов и отрегулируйте высоту в соответствии с ним. Расположите юстировочный диск из матового стекла в общей фокальной плоскости между SL2 и TL2, измеренной линейкой. После того, как излучающий свет заполнит заднее отверстие O3, установите диск из матового стекла в грубое положение датчика камеры и совместите центр диска с излучением, выходящим из O3. Расположите TL3 за объективом 3 и отрегулируйте наклон, чтобы выровнять исходящий свет с диском из матового стекла.
Установите камеру на измеренном расстоянии от объектива трубки и отрегулируйте объектив 3 в осевом направлении от ступени перемещения сепаратора до тех пор, пока отверстие не окажется в фокусе камеры. Отрегулируйте объектив 3 под углом 30 градусов к оптической оси объектива 2, используя линии на столе в качестве ориентира. Установите на место положительную мишень для проверки сетки на той же осевой высоте и осветите решетку ярким полевым светом.
Перемещайте находящуюся в фокусе часть поля зрения по экрану по горизонтали, в то время как квадраты сетки сохраняют одинаковый размер. Чтобы выровнять наклонный световой лист, расположите цилиндрические линзы, или CL, так, чтобы луч был сфокусирован в горизонтальном профиле листа в фокальной плоскости CL3. Вставьте и расположите прорезь в вертикальной ориентации в фокальной плоскости между CL3 и линзой 3.
На датчике камеры убедитесь, что световая пленка 0 градусов выглядит тонкой и вертикальной. Используя моторизованное управление ступенью перемещения, переместите M1 в сторону цилиндрических линз, чтобы наклонить световой лист. Вставьте предварительно подготовленный тестовый образец микротрубочек, меченных родамином, на предметный столик и отрегулируйте его в осевом направлении так, чтобы краситель освещался световым слоем на пяти различных глубинах между центром поля зрения и правой стороной экрана.
Затем сохраните каждое изображение. Откройте изображения на Фиджи. Для каждого изображения с помощью инструмента «Линия» нарисуйте горизонтальную линию от центра поля зрения до центра светового листа.
Затем перейдите в Analyze, а затем Plot Profile, чтобы рассчитать угол светового листа выше 01. После калибровки прибора установите заранее подготовленный трехмерный образец шарика и нажмите кнопку FSK на генераторе функций, чтобы задать треугольную волну. Чтобы найти сэмпл, используйте генератор функций, чтобы задать параметры, начиная с частоты 20 мегагерц, пиковой амплитуды 400 милливольт и смещения 0,4.
Прокрутите по оси Z вручную, пока не будет достигнута плоскость образца, и оптимизируйте настройку Z. В программе микроменеджера выберите время экспозиции и откройте окно многомерного захвата. Установите интервал равным 30 и используйте поле счетчика, чтобы выбрать количество кадров.
После того, как параметры установлены, запишите интервальную съемку для одного полного сканирования тома. Объемное сканирование восстановленной сети микротрубочек показало, что трехмерные структуры уплотняются к центру, что приводит к появлению ярких областей флуоресценции. В плоскостях визуализации вблизи покровного скольжения конфокальная микроскопия разрешила одиночные нити по периферии Astar с дополнительным фоном к центру из-за расфокусированных флуоресцентных сигналов сверху.
Однако перемещение на несколько микрон по оси Z быстро снизило качество изображений из-за расфокусированных плотных участков Astar. Одноплоскостная подсветка светового полотна устраняла сигналы расфокусировки, обеспечивая сопоставимое качество изображения между плоскостями.
