Para comenzar, asegúrese de que el diseño del microscopio esté preparado en la superficie de la mesa óptica con todas las distancias medidas con precisión. A continuación, monte el láser de excitación sobre la mesa. Coloque dos iris a la altura deseada del láser y utilícelos para asegurarse de que el haz esté nivelado y centrado.
Coloque la etapa de traslación, o TS1, debajo de la ubicación del espejo 1, o M1. Utilice el par de iris ajustados a la altura exacta para definir la trayectoria deseada del haz de salida y guiar la colocación y alineación de cada elemento reflectante. A continuación, coloque M1 en la parte superior del TS1. A continuación, monte y alinee el dicroico sobre la mesa.
Del mismo modo, monta el galvo y alinéalo con los iris. Una vez hechas las alineaciones, coloque M2 y luego sujete M3 a la mesa. Ajuste la altura y la posición hasta que la viga esté aproximadamente centrada en ambos discos de alineación de vidrio esmerilado.
A continuación, agregue soportes a M3. A continuación, comience a montar la lente 1 en la mesa. Ajuste la inclinación y la posición lateral hasta que el haz esté centrado en las placas de vidrio esmerilado por encima de M3. Coloque la lente 2 y verifique la colimación usando un espejo para hacer rebotar el haz en una superficie lejana.
Utilice una tarjeta de índice o un objetivo para trazar la viga y asegurarse de que la viga no cambie de tamaño. A continuación, ajuste la posición x, y del agujero de alfiler con la montura XY y la distancia axial con la platina unidimensional para maximizar la transmisión. Ajuste la lente 4 axialmente para enfocar el haz de excitación en la superficie del galvo y coloque la lente 3 sobre la mesa, seguida de SL1.
Ajuste la distancia axial de SL1 para formar un telescopio columado con lente 4 y, a continuación, coloque TL1 paralelo a SL1. Ajuste la altura del objetivo 1 en el sistema de jaulas hasta que la viga forme un disco aireado en el techo. Y luego continúe ajustando hasta que el tamaño del disco se minimice.
Coloque el espejo cuadrado en la etapa de muestreo del objetivo 1 y ajuste el espejo axialmente hasta que el tamaño del perfil del haz se minimice después del dicroico. Monte el láser de alineación deslizando las varillas de la jaula en los orificios vacíos de las dos placas de la jaula. Utilice un soporte de espejo cinemático y un espejo desplegable para alinear las trayectorias de los haces de alineación y excitación.
Coloque el espejo cuadrado axialmente en la etapa de muestra del objetivo 1 para minimizar el perfil del haz después del dicroico. Inserte SL2 y TL2 en el trayecto de emisión a las distancias respectivas. Ajuste las perillas XY y la inclinación del objetivo 2 para que el haz de alineación rojo pase a través del iris y el disco de vidrio esmerilado.
Ajuste la etapa de traslación 2 hasta que el haz forme un pequeño disco de aire en la superficie y, a continuación, continúe ajustando la etapa de traslación 2 para minimizar el tamaño del disco de aire. Para optimizar el galvo para la inclinación en el escaneo de variantes, presione el botón FSK en el generador de formas de onda para seleccionar una señal de onda triangular para el galvo y configúrela en una frecuencia baja, como 1 hercio. Observe la viga de alineación en la misma superficie o pared lejana.
Monte el objetivo 3 unos 4-5 milímetros delante del objetivo 2 en un ángulo de 0 grados y ajuste la altura para que coincida. Coloque un disco de alineación de vidrio esmerilado en el plano focal compartido entre SL2 y TL2 medido con una regla. Una vez que la luz de emisión llene la abertura posterior de O3, monte un disco de vidrio esmerilado en la posición aproximada del sensor de la cámara y alinee el centro del disco con la luz de emisión que sale de O3. Coloque TL3 detrás del objetivo 3 y ajuste la inclinación para alinear la luz saliente con el disco de vidrio esmerilado.
Coloque la cámara a la distancia medida de la lente de tubo y ajuste el objetivo 3 axialmente desde la etapa de traslación de la jaula hasta que el orificio esté enfocado en la cámara. Reajuste el objetivo 3 en un ángulo de 30 grados desde el eje óptico del objetivo 2 utilizando las líneas de la mesa como guía. Vuelva a montar el objetivo de prueba de rejilla positiva a la misma altura axial e ilumine la rejilla con la luz de campo brillante.
Barre horizontalmente la parte enfocada del campo de visión a través de la pantalla mientras los cuadrados de la cuadrícula mantienen un tamaño uniforme. Para alinear la hoja de luz oblicua, coloque lentes cilíndricas, o CL, de modo que el haz se enfoque en un perfil de hoja horizontal en el plano focal de CL3. Inserte y coloque una hendidura en la orientación vertical en el plano focal entre CL3 y la lente 3.
En el sensor de la cámara, confirme que la hoja de luz de 0 grados parece delgada y vertical. Con el control de platina de traslación motorizado, traslade M1 hacia las lentes cilíndricas para inclinar la hoja de luz. Inserte la muestra de prueba de microtúbulos marcados con rodamina previamente preparada en la platina de muestra y ajústela axialmente para que el tinte sea iluminado por la lámina de luz a cinco profundidades diferentes entre el centro del campo de visión y el lado derecho de la pantalla.
A continuación, guarde cada imagen. Abre las imágenes en Fiyi. Para cada imagen, con la herramienta Línea, dibuje una línea horizontal desde el centro del campo de visión hasta el centro de la hoja de luz.
A continuación, vaya a Analizar, seguido de Perfil de trazado para calcular el ángulo de la hoja de luz por encima de 01. Después de calibrar el instrumento, monte la muestra de perlas tridimensionales preparada previamente y haga clic en el botón FSK en el generador de funciones para establecer una onda triangular. Para encontrar la muestra, utilice el generador de funciones para establecer los parámetros a partir de una frecuencia de 20 megahercios, una amplitud de pico a pico de 400 milivoltios y un desplazamiento de 0,4.
Desplácese en Z manualmente hasta alcanzar el plano de muestra y optimice la configuración de Z. En el programa micromanager, seleccione un tiempo de exposición y abra la ventana de adquisición multidimensional. Establezca el intervalo en 30 y utilice el cuadro de recuento para elegir el número de fotogramas.
Una vez configurados los parámetros, grabe un lapso de tiempo para un escaneo completo del volumen. Los escaneos volumétricos de la red de microtúbulos reconstituidos mostraron que las estructuras tridimensionales se volvieron densas hacia el centro, lo que resultó en regiones brillantes de fluorescencia. En los planos de obtención de imágenes cerca del cubreobjetos, la microscopía confocal resolvió filamentos individuales alrededor de la periferia de la estrella con un fondo adicional hacia el centro debido a las señales fluorescentes desenfocadas desde arriba.
Sin embargo, moverse unas pocas micras en Z redujo rápidamente la calidad de las imágenes debido a las secciones densas y desenfocadas del Astar. La iluminación de un solo plano de la lámina de luz eliminó las señales desenfocadas, lo que permitió una calidad de imagen comparable entre los planos.
