Till att börja med, se till att mikroskoplayouten är förberedd på ytan av det optiska bordet med alla avstånd noggrant uppmätta. Montera sedan excitationslasern på bordet. Ställ in två iris på den avsedda höjden på lasern och använd dessa iris för att säkerställa att strålen är jämn och centrerad.
Placera översättningssteget, eller TS1, under platsen för spegel 1 eller M1. Använd paret iris inställd på exakt höjd för att definiera önskad utgångsstrålbana och styra placeringen och inriktningen av varje reflekterande element. Placera sedan M1 högst upp på TS1. Montera och rikta sedan dikroiken över bordet.
På samma sätt monterar du galvo och riktar in den med irisen. När inriktningarna är gjorda, position M2 och sedan clamp M3 till bordet. Justera höjden och positionen tills strålen är ungefär centrerad på båda inriktningsskivorna av frostat glas.
Lägg till stöd till M3 då. Börja sedan montera lins 1 på bordet. Justera lutningen och sidoläget tills strålen är centrerad på de frostade glasplattorna ovanför M3. Placera lins 2 och kontrollera kollimeringen genom att använda en spegel för att studsa strålen på en avlägsen yta.
Använd ett indexkort eller mål för att spåra strålen och se till att strålen inte ändras i storlek. Justera sedan x, y-positionen för hålet med XY-fästet och det axiella avståndet med det endimensionella steget för att maximera överföringen. Justera lins 4 axiellt för att fokusera excitationsstrålen på galvons yta och ordna lins 3 på bordet, följt av SL1.
Justera det axiella avståndet för SL1 för att bilda ett kolumerat teleskop med lins 4, placera sedan TL1 parallellt med SL1. Justera höjden på objektiv 1 på bursystemet tills strålen bildar en luftig skiva i taket. Och fortsätt sedan att justera tills skivans storlek är minimerad.
Placera den fyrkantiga spegeln på provsteget för mål 1 och justera spegeln axiellt tills storleken på strålprofilen minimeras efter dikroiken. Montera inriktningslasern genom att skjuta in hållarstängerna i de tomma hålen på de två hållarplattorna. Använd ett kinematisk spegelfäste och en listrutespegel för att justera banorna för justerings- och excitationsstrålarna.
Placera den fyrkantiga spegeln axiellt på provsteget för mål 1 för att minimera strålprofilen efter dikroiken. Sätt in SL2 och TL2 i utsläppsbanan på respektive avstånd. Justera XY-rattarna och lutningen på objektiv 2 så att den röda inriktningsstrålen passerar genom bländaren och den frostade glasskivan.
Justera förflyttningssteg 2 tills strålen bildar en liten luftig skiva på ytan och fortsätt sedan att justera förflyttningssteg 2 för att minimera storleken på den luftiga skivan. För att optimera galvoen för lutning i variantskanning, tryck på FSK-knappen på vågformsgeneratorn för att välja en triangelvågsignal för galvoen och ställ in den på en låg frekvens, till exempel 1 hertz. Observera inriktningsbalken på samma avlägsna yta eller vägg.
Montera objektiv 3 ca 4-5 millimeter framför objektiv 2 i 0 graders vinkel och justera höjden så att den matchar. Placera en justeringsskiva av frostat glas i det delade fokalplanet mellan SL2 och TL2 mätt med en linjal. När emissionsljuset fyller den bakre bländaren på O3, montera en frostad glasskiva i det grova läget för kamerasensorn och rikta in mitten av skivan mot emissionsljuset som lämnar O3. Placera TL3 bakom mål 3 och justera lutningen för att rikta in det utgående ljuset med den frostade glasskivan.
Placera kameran på det uppmätta avståndet från rörlinsen och justera objektiv 3 axiellt från burens översättningssteg tills hålet är i fokus på kameran. Justera mål 3 i 30 graders vinkel från den optiska axeln för mål 2 med hjälp av linjerna i tabellen som vägledning. Montera tillbaka det positiva gallertestmålet på samma axiella höjd och lys upp gallret med det starka fältljuset.
Svep den del av synfältet som är i fokus över skärmen horisontellt medan rutnätsrutorna behåller en enhetlig storlek. För att rikta in det sneda ljusarket, placera cylindriska linser, eller CL, så att strålen fokuseras i en horisontell arkprofil vid fokalplanet för CL3. Sätt i och placera en skåra i vertikal orientering vid fokalplanet mellan CL3 och lins 3.
Vid kamerasensorn, kontrollera att 0 graders ljusarket verkar tunt och vertikalt. Använd den motoriserade översättningsstegskontrollen och översätt M1 mot de cylindriska linserna för att vinkla ljusarket. Sätt in det förberedda rhodaminmärkta mikrotubulitestprovet på provsteget och justera det axiellt så att färgämnet belyses av ljusarket på fem olika djup mellan mitten av synfältet och skärmens högra sida.
Spara sedan varje bild. Öppna bilderna i Fiji. För varje bild använder du linjeverktyget för att rita en vågrät linje från mitten av synfältet till mitten av det ljusa arket.
Gå sedan till Analysera, följt av Plot Profile för att beräkna vinkeln på ljusarket över 01. Efter kalibrering av instrumentet, montera det förberedda tredimensionella pärlprovet och klicka på FSK-knappen på funktionsgeneratorn för att ställa in en triangelvåg. För att hitta provet, använd funktionsgeneratorn för att ställa in parametrarna från 20 megahertzfrekvens, 400 millivolt topp till toppamplitud och 0,4 offset.
Bläddra i Z manuellt tills exempelplanet har nåtts och optimera Z-inställningen. I mikromanagerprogrammet väljer du en exponeringstid och öppnar det flerdimensionella insamlingsfönstret. Ange intervallet till 30 och använd rutan antal för att välja antal bildrutor.
När parametrarna är inställda, spela in en time lapse för en fullständig genomsökning av volymen. De volymetriska skanningarna av det rekonstituerade mikrotubulinätverket visade att de tredimensionella strukturerna växte tätt mot mitten, vilket resulterade i ljusa områden med fluorescens. I avbildningsplan nära täckglaset upplöste konfokalmikroskopi enstaka filament runt Astars periferi med ytterligare bakgrund mot mitten på grund av oskarpa fluorescerande signaler ovanifrån.
Att flytta några mikrometer i Z minskade dock snabbt kvaliteten på bilderna på grund av de oskarpa täta sektionerna av Astar. Ljusarkets belysning i ett plan eliminerade de oskarpa signalerna, vilket möjliggjorde jämförbar bildkvalitet mellan planen.