processing micro-ct scanned image of stained murine neonatal brain sample

Mikro-CT-Scannen und Bildverarbeitung des Gehirns von Mäusen bei Neugeborenen

Micro-computed tomography (micro-CT) imaging is a valuable tool for different fields of research. In biology, it is especially suitable for bone research because of X-ray absorption in mineralized tissues. Due to this feature, diverse questions regarding bone development1, metabolism2, and evolution3,4, among other topics, have been approached with the assistance of micro-CT. In 2008, de Crespigny et al.5 showed that micro-CT images of adult mouse and rabbit brains could be obtained using iodine as a contrast agent. This work opened a new application for this imaging technique, since iodine allowed the acquisition of images from soft tissues which otherwise would be insensitive to X-rays. Thus, the general goal of combining micro-CT and an iodine-based contrast agent is to obtain high-resolution images, in which soft tissues can be distinguished and identified at a meso or macro anatomical level.
This technique has notable potential for studies that require detailed ex vivo phenotypic characterization of small specimens, such as mouse embryos, which are widely used in experimental designs6. Iodine contrast in combination with micro-CT imaging has been used to obtain volumetric quantifications of organs7 and landmark three-dimensional (3D) structures8,9. In recent years, micro-CT scanning of stained samples has been applied to describe brain phenotypic features of rodents10, and different improvements to the technique have been proposed. For adult brains, a protocol of 48 h of immersion in iodine, with a previous step of perfusion with a hydrogel, was found to produce images of high quality11. Gignac et al.12 expanded the limits of this technique by showing that rat brains stained with iodine could be processed to perform routine histological techniques. Similarly, these procedures demonstrate promising results for embryonic and pre-weaning rodent brains8,13,14,15.
Although neuroscience has largely applied microscope-based techniques to assess different structural and functional aspects of brain development, such studies are more suitable for characterizing specific cell populations or spatially limited structures. Conversely, micro-CT imaging allows the description of whole structures and the acquisition of 3D models that preserve relevant spatial information, which is complementary to microscopic techniques. Magnetic resonance imaging (MRI) is also a standard technique applied to explore the structural features of small animals16,17,18. However, micro-CT, with the use of a contrast agent, has two main advantages for ex vivo fixed samples: micro-CT scanners are largely less expensive and easy to operate, and allow a higher spatial resolution than MRI12.
This work aims to describe the procedure to obtain high-resolution images from neonatal mouse brains using micro-CT scanning after staining with Lugol&#39;s solution, an iodine-based contrast agent. A comprehensive protocol is presented, which starts with preliminary stages such as sample collection and fixation of tissues, and goes through staining, micro-CT image acquisition, and standard processing. Image processing includes the segmentation of a 3D volume of the complete head, as well as of the brain, and the selection of specific anatomical planes to digitize point coordinates that could be then used in morphometric analyses. Although the focus here is the neonatal mouse brain, similar strategies can be applied to other soft tissues. Thus, the protocol presented here is flexible enough to be applied, with subtle modifications, to other types of samples.

Autor im Rampenlicht: Hochauflösende Bildgebung von Gehirnen von Mäusen – ein Mikro-CT-Protokoll mit Lugols Lösungskontrastmittel

Mikro-CT-Bildgebung und morphometrische Analyse von Neugeborenengehirnen von Mäusen

In experimental neuroscience, specifically for those studies addressing questions about development, it is relevant to count on quantitative characterization of brains of embryonic and prenatal specimens. Micro computed tomography in combination with a common contrast agent is capable of producing high solution images suitable for further morphometric analysis. Micro computed tomography has been applied to imaging hard tissue such as bone because of x-ray absorption in mineralized tissues.However, in the last decades, the use of Lugol's solution as a contrast agent has upgraded the application of using machine technique for soft tissues. This protocol combines procedures and tools using the field to demonstrate the great potential of micro computed tomography for studying the prenatal brains of small animals. The strength of our proposal, precisely depicting the process from the sample preparation to morphometric data processing.Images derived from micro computed tomography preserve a special information, which is difficult with standard histological techniques. Additionally, micro computed tomography with the use of a contrast agent has two advantages when compared with magnetic resonance. Scanners are less expensive and easy to operate and allow a higher spatial resolution.The protocol presented here could be applied with subtle modifications to fix samples of different organs derived from diverse species. Then a variety of scientific questions could be approached. Since the contrast agent is administered by emersion, the main limitations should be related to the sample size, but the potential applications are enormous.

Verarbeitung eines Mikro-CT-gescannten Bildes einer gefärbten murinen Neugeborenen-Gehirnprobe

Starten Sie zunächst die Bildverarbeitungssoftware, wählen Sie die Datei aus, öffnen Sie dann die Daten und wählen Sie die zuvor generierten Micro-CT-gescannten Bilder im Punkt-BMP-Format aus. Wenn sich das Fenster der Bildleseparameter öffnet, bestätigen Sie die Parameter und bestätigen Sie, wenn sie korrekt sind. Klicken Sie im Hauptfenster auf Projektansicht, um ein neues Objekt zu finden, das mit dem Namen der Punkt-BMP-Datei erstellt wurde.Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das erstellte Objekt, wählen Sie die Option Ortho-Slice und klicken Sie dann auf Erstellen. Wählen Sie unter Eigenschaften die Ausrichtungsebene und die anzuzeigende Schnittnummer aus. Um 3D-Volumen des gesamten Kopfes im Hauptfenster zu erhalten, gehen Sie zur Projektansicht, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Bildobjekt, wählen Sie die Option "Interaktiver Schwellenwert" und klicken Sie auf "Erstellen".Ändern Sie unter Eigenschaften die Werte für den minimalen Schwellenwert RGB und den maximalen Schwellenwert RGB, bis der Teil des Bildes ausgewählt ist, der dem Kopf des Tieres entspricht. Wählen Sie dann Anwenden aus. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Schwellenwertobjekt, das in der Projektansicht erstellt wurde.Wählen Sie in den Eigenschaften Isosurface aus, wählen Sie einen Schwellenwert aus, um die Oberfläche zu visualisieren, und klicken Sie dann auf Anwenden. Um die Orientierungspunkte zu digitalisieren, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Projektansicht, wählen Sie Objekt erstellen, wählen Sie dann Punkte und Linien gefolgt von Orientierungspunkten aus und klicken Sie dann auf Erstellen. Klicken Sie dann mit der rechten Maustaste auf die neuen Objekt-Orientierungspunkte.Wählen Sie die Orientierungspunktansicht und klicken Sie auf Erstellen. Ändern Sie unter Größe die Punktgröße. Um Orientierungspunkte in Eigenschaften hinzuzufügen, wählen Sie im Bearbeitungsmodus Hinzufügen aus.Digitalisieren Sie fünf gleichmäßig verteilte Punkte um die Kurven bis zum nächsten Orientierungspunkt am Mittelhirnkortex-Schnittpunkt, dann digitalisieren Sie acht Halblandmarken um den Kortex. Um die digitalisierten Punkte zu speichern, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf Objektorientierungspunkte und wählen Sie Daten speichern. Um das Gehirn zu segmentieren, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Projektansicht, gefolgt von Objekt erstellen, wählen Sie Bilder und Felder aus und beschriften Sie das Feld.Klicken Sie auf Erstellen. Wählen Sie das Beschriftungsfeldobjekt aus und klicken Sie in den Eigenschaften auf die Option Segmentierungseditor. Fügen Sie unter Materialien ein neues Material hinzu und benennen Sie es in Gehirn um.Wählen Sie unter Auswahl die aktuelle Scheibe aus, um das Gewebe zu segmentieren, das dem Gehirn in jeder Schicht entspricht. Verwenden Sie in Werkzeugen den Zauberstab und den Pinsel, um das Gehirngewebe in jeder Scheibe auszuwählen. Drücken Sie dann unter Auswahl auf Hinzufügen.Kehren Sie nun zur Projektansicht zurück, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Beschriftungsfeld, wählen Sie Oberfläche generieren und klicken Sie dann auf Übernehmen. Sobald die Oberfläche erhalten ist, wenden Sie die Extraktionsoberfläche an, um sie zu exportieren. Mit Mikro-CT-Scans können trotz der geringen Größe des neonatalen Mäusegehirns die anatomischen Strukturen wie Riechkolben, Kortex, Mittelhirn, Kleinhirn und Hinterhirn unterschieden werden.Die manuelle Segmentierung des gesamten Gehirns führte zur 3D-Modellrekonstruktion des Gehirns der Neugeborenen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Processing Micro-CT Scanned Image of Stained Murine Neonatal Brain Sample

Micro-CT Imaging and Morphometric Analysis of Mouse Neonatal Brains

Neuroimages are a valuable tool for studying brain morphology in experiments using animal models. Magnetic resonance imaging (MRI) has become the standard ...

Forschung

Neurowissenschaften

Murine Neonatal Brain Sample Fixation and Staining for Micro-CT Scanning

Fixierung und Färbung von murinen Neugeborenen-Gehirnproben für Mikro-CT-Scans