processing micro-ct scanned image of stained murine neonatal brain sample

עכבר מוח יילודים סריקת מיקרו-CT ועיבוד תמונה

Micro-computed tomography (micro-CT) imaging is a valuable tool for different fields of research. In biology, it is especially suitable for bone research because of X-ray absorption in mineralized tissues. Due to this feature, diverse questions regarding bone development1, metabolism2, and evolution3,4, among other topics, have been approached with the assistance of micro-CT. In 2008, de Crespigny et al.5 showed that micro-CT images of adult mouse and rabbit brains could be obtained using iodine as a contrast agent. This work opened a new application for this imaging technique, since iodine allowed the acquisition of images from soft tissues which otherwise would be insensitive to X-rays. Thus, the general goal of combining micro-CT and an iodine-based contrast agent is to obtain high-resolution images, in which soft tissues can be distinguished and identified at a meso or macro anatomical level.
This technique has notable potential for studies that require detailed ex vivo phenotypic characterization of small specimens, such as mouse embryos, which are widely used in experimental designs6. Iodine contrast in combination with micro-CT imaging has been used to obtain volumetric quantifications of organs7 and landmark three-dimensional (3D) structures8,9. In recent years, micro-CT scanning of stained samples has been applied to describe brain phenotypic features of rodents10, and different improvements to the technique have been proposed. For adult brains, a protocol of 48 h of immersion in iodine, with a previous step of perfusion with a hydrogel, was found to produce images of high quality11. Gignac et al.12 expanded the limits of this technique by showing that rat brains stained with iodine could be processed to perform routine histological techniques. Similarly, these procedures demonstrate promising results for embryonic and pre-weaning rodent brains8,13,14,15.
Although neuroscience has largely applied microscope-based techniques to assess different structural and functional aspects of brain development, such studies are more suitable for characterizing specific cell populations or spatially limited structures. Conversely, micro-CT imaging allows the description of whole structures and the acquisition of 3D models that preserve relevant spatial information, which is complementary to microscopic techniques. Magnetic resonance imaging (MRI) is also a standard technique applied to explore the structural features of small animals16,17,18. However, micro-CT, with the use of a contrast agent, has two main advantages for ex vivo fixed samples: micro-CT scanners are largely less expensive and easy to operate, and allow a higher spatial resolution than MRI12.
This work aims to describe the procedure to obtain high-resolution images from neonatal mouse brains using micro-CT scanning after staining with Lugol&#39;s solution, an iodine-based contrast agent. A comprehensive protocol is presented, which starts with preliminary stages such as sample collection and fixation of tissues, and goes through staining, micro-CT image acquisition, and standard processing. Image processing includes the segmentation of a 3D volume of the complete head, as well as of the brain, and the selection of specific anatomical planes to digitize point coordinates that could be then used in morphometric analyses. Although the focus here is the neonatal mouse brain, similar strategies can be applied to other soft tissues. Thus, the protocol presented here is flexible enough to be applied, with subtle modifications, to other types of samples.

מחבר זרקור: הדמיה ברזולוציה גבוהה של מוחות יילודים של עכברים – פרוטוקול מיקרו-CT עם חומר הניגוד לפתרון של לוגול

הדמיית מיקרו-CT וניתוח מורפומטרי של מוחות יילודים בעכברים

In experimental neuroscience, specifically for those studies addressing questions about development, it is relevant to count on quantitative characterization of brains of embryonic and prenatal specimens. Micro computed tomography in combination with a common contrast agent is capable of producing high solution images suitable for further morphometric analysis. Micro computed tomography has been applied to imaging hard tissue such as bone because of x-ray absorption in mineralized tissues.However, in the last decades, the use of Lugol's solution as a contrast agent has upgraded the application of using machine technique for soft tissues. This protocol combines procedures and tools using the field to demonstrate the great potential of micro computed tomography for studying the prenatal brains of small animals. The strength of our proposal, precisely depicting the process from the sample preparation to morphometric data processing.Images derived from micro computed tomography preserve a special information, which is difficult with standard histological techniques. Additionally, micro computed tomography with the use of a contrast agent has two advantages when compared with magnetic resonance. Scanners are less expensive and easy to operate and allow a higher spatial resolution.The protocol presented here could be applied with subtle modifications to fix samples of different organs derived from diverse species. Then a variety of scientific questions could be approached. Since the contrast agent is administered by emersion, the main limitations should be related to the sample size, but the potential applications are enormous.

עיבוד תמונה סרוקה של מיקרו-CT של דגימת מוח של יילוד מורין מוכתם

כדי להתחיל, הפעל את תוכנת עיבוד התמונה, בחר קובץ ולאחר מכן פתח נתונים ובחר את התמונות שנסרקו מיקרו CT שנוצרו בעבר בפורמט נקודה BMP. כאשר החלון של הפרמטרים לקרוא את התמונה נפתח, לאשר את הפרמטרים ולקבל אם נכון. בחלונית הראשית, לחץ על תצוגת הפרויקט כדי לאתר אובייקט חדש שנוצר עם שם קובץ BMP נקודות.לחצו לחיצה ימנית על העצם שנוצר ובחרו באפשרות ortho slice, ואחר כך לחצו על create. תחת מאפיינים, בחרו במישור הכיוון ובמספר הפרוסה שיש לראות. כדי לקבל נפחים תלת-ממדיים של הראש המלא בחלונית הראשית, עבור לתצוגת Project, לחץ לחיצה ימנית על אובייקט התמונה, בחר באפשרות הסף האינטראקטיבי ולחץ על צור.תחת מאפיינים, שנו את הערכים לסף RGB מינימלי ולסף RGB מרבי עד לבחירת החלק בתמונה המתאים לראש החיה. לאחר מכן בחר החל. לחץ לחיצה ימנית על אובייקט הסף שנוצר מתחת לתצוגת הפרויקט.במאפיינים, בחר isosurface, בחר סף כדי להציג את המשטח באופן חזותי ולאחר מכן לחץ על החל. כדי להפוך את ציוני הדרך לדיגיטליים, לחץ לחיצה ימנית על תצוגת פרויקט, בחר צור אובייקט, לאחר מכן בחר נקודות וקווים ולאחר מכן ציוני דרך, ולאחר מכן לחץ על צור. לאחר מכן לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על ציוני הדרך של האובייקט החדש.בחר תצוגת ציון דרך ולחץ על צור. תחת גודל, שנה את גודל הנקודה. כדי להוסיף ציוני דרך במאפיינים, במצב עריכה, בחר הוסף.בצעו דיגיטציה של חמש נקודות המפוזרות באופן שווה סביב העקומות עד לנקודת הציון הבאה בצומת קליפת המוח התיכונה, ולאחר מכן בצעו דיגיטציה של שמונה נקודות ציון למחצה סביב קליפת המוח. כדי לשמור את הנקודות הדיגיטליות, לחץ לחיצה ימנית על ציוני דרך של אובייקטים ובחר שמור נתונים. כדי לפלח את המוח, לחץ לחיצה ימנית על תצוגת פרויקט, ואחריו צור אובייקט, בחר תמונות ושדות, ולאחר מכן תיוג שדה.לחץ על צור. בחר באובייקט שדה התווית, ולחץ על האפשרות עורך הפילוח במאפיינים. תחת חומרים, הוסף חומר חדש ושנה את שמו למוח.תחת בחירה, בחרו בפרוסה הנוכחית כדי לפלח את הרקמה המתאימה למוח בכל פרוסה. בכלים, השתמשו בשרביט הקסמים ובמברשת כדי לבחור את רקמת המוח בכל פרוסה. לאחר מכן, תחת בחירה, הקש על הוסף.כעת חזור לתצוגת הפרויקט, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על שדה התווית ובחר צור משטח ולאחר מכן לחץ על החל. לאחר קבלת המשטח, יש למרוח משטח חילוץ כדי לייצא אותו. באמצעות סריקת מיקרו-CT, למרות גודלם הקטן של מוחות עכברי יילודים, ניתן להבחין במבנים אנטומיים כגון פקעות הריח, קליפת המוח, המוח האמצעי, המוח הקטן והמוח האחורי.הסגמנטציה הידנית של המוח כולו הביאה לשחזור מודל תלת-ממדי של מוח היילודים.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Processing Micro-CT Scanned Image of Stained Murine Neonatal Brain Sample

Micro-CT Imaging and Morphometric Analysis of Mouse Neonatal Brains

Neuroimages are a valuable tool for studying brain morphology in experiments using animal models. Magnetic resonance imaging (MRI) has become the standard ...

Murine Neonatal Brain Sample Fixation and Staining for Micro-CT Scanning

קיבוע וצביעת דגימת מוח ביילודים של מורין לסריקת מיקרו-CT