processing micro-ct scanned image of stained murine neonatal brain sample

Micro-TC del cervello neonatale del topo Scansione ed elaborazione delle immagini

Micro-computed tomography (micro-CT) imaging is a valuable tool for different fields of research. In biology, it is especially suitable for bone research because of X-ray absorption in mineralized tissues. Due to this feature, diverse questions regarding bone development1, metabolism2, and evolution3,4, among other topics, have been approached with the assistance of micro-CT. In 2008, de Crespigny et al.5 showed that micro-CT images of adult mouse and rabbit brains could be obtained using iodine as a contrast agent. This work opened a new application for this imaging technique, since iodine allowed the acquisition of images from soft tissues which otherwise would be insensitive to X-rays. Thus, the general goal of combining micro-CT and an iodine-based contrast agent is to obtain high-resolution images, in which soft tissues can be distinguished and identified at a meso or macro anatomical level.
This technique has notable potential for studies that require detailed ex vivo phenotypic characterization of small specimens, such as mouse embryos, which are widely used in experimental designs6. Iodine contrast in combination with micro-CT imaging has been used to obtain volumetric quantifications of organs7 and landmark three-dimensional (3D) structures8,9. In recent years, micro-CT scanning of stained samples has been applied to describe brain phenotypic features of rodents10, and different improvements to the technique have been proposed. For adult brains, a protocol of 48 h of immersion in iodine, with a previous step of perfusion with a hydrogel, was found to produce images of high quality11. Gignac et al.12 expanded the limits of this technique by showing that rat brains stained with iodine could be processed to perform routine histological techniques. Similarly, these procedures demonstrate promising results for embryonic and pre-weaning rodent brains8,13,14,15.
Although neuroscience has largely applied microscope-based techniques to assess different structural and functional aspects of brain development, such studies are more suitable for characterizing specific cell populations or spatially limited structures. Conversely, micro-CT imaging allows the description of whole structures and the acquisition of 3D models that preserve relevant spatial information, which is complementary to microscopic techniques. Magnetic resonance imaging (MRI) is also a standard technique applied to explore the structural features of small animals16,17,18. However, micro-CT, with the use of a contrast agent, has two main advantages for ex vivo fixed samples: micro-CT scanners are largely less expensive and easy to operate, and allow a higher spatial resolution than MRI12.
This work aims to describe the procedure to obtain high-resolution images from neonatal mouse brains using micro-CT scanning after staining with Lugol&#39;s solution, an iodine-based contrast agent. A comprehensive protocol is presented, which starts with preliminary stages such as sample collection and fixation of tissues, and goes through staining, micro-CT image acquisition, and standard processing. Image processing includes the segmentation of a 3D volume of the complete head, as well as of the brain, and the selection of specific anatomical planes to digitize point coordinates that could be then used in morphometric analyses. Although the focus here is the neonatal mouse brain, similar strategies can be applied to other soft tissues. Thus, the protocol presented here is flexible enough to be applied, with subtle modifications, to other types of samples.

Autore in primo piano: Imaging ad alta risoluzione del cervello di un neonato di topo - Un protocollo Micro-CT con l&#39;agente di contrasto in soluzione di Lugol

Imaging micro-CT e analisi morfometrica del cervello neonatale del topo

In experimental neuroscience, specifically for those studies addressing questions about development, it is relevant to count on quantitative characterization of brains of embryonic and prenatal specimens. Micro computed tomography in combination with a common contrast agent is capable of producing high solution images suitable for further morphometric analysis. Micro computed tomography has been applied to imaging hard tissue such as bone because of x-ray absorption in mineralized tissues.However, in the last decades, the use of Lugol's solution as a contrast agent has upgraded the application of using machine technique for soft tissues. This protocol combines procedures and tools using the field to demonstrate the great potential of micro computed tomography for studying the prenatal brains of small animals. The strength of our proposal, precisely depicting the process from the sample preparation to morphometric data processing.Images derived from micro computed tomography preserve a special information, which is difficult with standard histological techniques. Additionally, micro computed tomography with the use of a contrast agent has two advantages when compared with magnetic resonance. Scanners are less expensive and easy to operate and allow a higher spatial resolution.The protocol presented here could be applied with subtle modifications to fix samples of different organs derived from diverse species. Then a variety of scientific questions could be approached. Since the contrast agent is administered by emersion, the main limitations should be related to the sample size, but the potential applications are enormous.

Elaborazione dell'immagine scansionata con micro-TC di un campione di cervello neonatale murino colorato

Per iniziare, avvia il software di elaborazione delle immagini, seleziona file, quindi apri i dati e scegli le immagini scansionate micro CT generate in precedenza in formato dot BMP. Quando si apre la finestra dei parametri di lettura dell'immagine, confermare i parametri e accettare se corretti. Nel pannello principale, fare clic sulla vista progetto per individuare un nuovo oggetto creato con il nome del file BMP del punto.Fare clic con il pulsante destro del mouse sull'oggetto creato e selezionare l'opzione ortofetta, quindi fare clic su Crea. In Proprietà, selezionare il piano di orientamento e il numero di sezione da visualizzare. Per ottenere i volumi 3D della testa completa nel pannello principale, passare alla vista progetto, fare clic con il pulsante destro del mouse sull'oggetto immagine, selezionare l'opzione di soglia interattiva e fare clic su Crea.In Proprietà, modificare i valori per la soglia minima RGB e la soglia massima RGB fino a selezionare la parte dell'immagine corrispondente alla testa dell'animale. Quindi seleziona Applica. Fare clic con il pulsante destro del mouse sull'oggetto soglia creato nella vista del progetto.In Proprietà selezionare isosuperficie, scegliere una soglia per visualizzare la superficie, quindi fare clic su Applica. Per digitalizzare i punti di riferimento, fare clic con il pulsante destro del mouse sulla vista del progetto, selezionare crea oggetto, quindi selezionare punti e linee seguiti da punti di riferimento, quindi fare clic su crea. Quindi fare clic con il pulsante destro del mouse sui nuovi punti di riferimento dell'oggetto.Selezionare la vista punto di riferimento e fare clic su Crea. In dimensione, modificare la dimensione in punti. Per aggiungere punti di riferimento nelle proprietà, in modalità di modifica selezionare Aggiungi.Digitalizza cinque punti equamente distribuiti intorno alle curve fino al prossimo punto di riferimento all'intersezione della corteccia mesencefalica, quindi digitalizza otto semi punti di riferimento intorno alla corteccia. Per salvare i punti digitalizzati, fare clic con il pulsante destro del mouse sui punti di riferimento dell'oggetto e scegliere Salva dati. Per segmentare il cervello, fare clic con il pulsante destro del mouse sulla vista progetto, quindi creare oggetto, selezionare immagini e campi, quindi etichettare il campo.Fare clic su Crea. Selezionare l'oggetto campo etichetta e premere l'opzione dell'editor di segmentazione nelle proprietà. In Materiali, aggiungi un nuovo materiale e rinominalo come cervello.In Selezione, scegliere la sezione corrente per segmentare il tessuto corrispondente al cervello in ciascuna sezione. Negli strumenti, usa la bacchetta magica e il pennello per selezionare il tessuto cerebrale in ogni fetta. Quindi, in Selezione, premere Aggiungi.Ora torna alla vista del progetto, fai clic con il pulsante destro del mouse sul campo dell'etichetta e seleziona genera superficie, quindi fai clic su Applica. Una volta ottenuta la superficie, applicare la superficie di estrazione per esportarla. Con la scansione micro TC, nonostante le piccole dimensioni del cervello dei topi neonatali, è possibile distinguere le strutture anatomiche come i bulbi olfattivi, la corteccia, il mesencefalo, il cervelletto e il cervello posteriore.La segmentazione manuale dell'intero cervello ha portato alla ricostruzione del modello 3D del cervello dei neonati.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Processing Micro-CT Scanned Image of Stained Murine Neonatal Brain Sample

Micro-CT Imaging and Morphometric Analysis of Mouse Neonatal Brains

Neuroimages are a valuable tool for studying brain morphology in experiments using animal models. Magnetic resonance imaging (MRI) has become the standard ...

Ricerca

Neuroscienze

Murine Neonatal Brain Sample Fixation and Staining for Micro-CT Scanning

Fissazione e colorazione di campioni cerebrali neonatali murini per la scansione micro-CT