processing micro-ct scanned image of stained murine neonatal brain sample

マウス新生児脳マイクロCTスキャンと画像処理

Micro-computed tomography (micro-CT) imaging is a valuable tool for different fields of research. In biology, it is especially suitable for bone research because of X-ray absorption in mineralized tissues. Due to this feature, diverse questions regarding bone development1, metabolism2, and evolution3,4, among other topics, have been approached with the assistance of micro-CT. In 2008, de Crespigny et al.5 showed that micro-CT images of adult mouse and rabbit brains could be obtained using iodine as a contrast agent. This work opened a new application for this imaging technique, since iodine allowed the acquisition of images from soft tissues which otherwise would be insensitive to X-rays. Thus, the general goal of combining micro-CT and an iodine-based contrast agent is to obtain high-resolution images, in which soft tissues can be distinguished and identified at a meso or macro anatomical level.
This technique has notable potential for studies that require detailed ex vivo phenotypic characterization of small specimens, such as mouse embryos, which are widely used in experimental designs6. Iodine contrast in combination with micro-CT imaging has been used to obtain volumetric quantifications of organs7 and landmark three-dimensional (3D) structures8,9. In recent years, micro-CT scanning of stained samples has been applied to describe brain phenotypic features of rodents10, and different improvements to the technique have been proposed. For adult brains, a protocol of 48 h of immersion in iodine, with a previous step of perfusion with a hydrogel, was found to produce images of high quality11. Gignac et al.12 expanded the limits of this technique by showing that rat brains stained with iodine could be processed to perform routine histological techniques. Similarly, these procedures demonstrate promising results for embryonic and pre-weaning rodent brains8,13,14,15.
Although neuroscience has largely applied microscope-based techniques to assess different structural and functional aspects of brain development, such studies are more suitable for characterizing specific cell populations or spatially limited structures. Conversely, micro-CT imaging allows the description of whole structures and the acquisition of 3D models that preserve relevant spatial information, which is complementary to microscopic techniques. Magnetic resonance imaging (MRI) is also a standard technique applied to explore the structural features of small animals16,17,18. However, micro-CT, with the use of a contrast agent, has two main advantages for ex vivo fixed samples: micro-CT scanners are largely less expensive and easy to operate, and allow a higher spatial resolution than MRI12.
This work aims to describe the procedure to obtain high-resolution images from neonatal mouse brains using micro-CT scanning after staining with Lugol&#39;s solution, an iodine-based contrast agent. A comprehensive protocol is presented, which starts with preliminary stages such as sample collection and fixation of tissues, and goes through staining, micro-CT image acquisition, and standard processing. Image processing includes the segmentation of a 3D volume of the complete head, as well as of the brain, and the selection of specific anatomical planes to digitize point coordinates that could be then used in morphometric analyses. Although the focus here is the neonatal mouse brain, similar strategies can be applied to other soft tissues. Thus, the protocol presented here is flexible enough to be applied, with subtle modifications, to other types of samples.

著者スポットライト:マウス新生児の脳の高解像度イメージング – ルゴール溶液造影剤によるマイクロCTプロトコル

マウス新生児脳のマイクロCTイメージングと形態解析

In experimental neuroscience, specifically for those studies addressing questions about development, it is relevant to count on quantitative characterization of brains of embryonic and prenatal specimens. Micro computed tomography in combination with a common contrast agent is capable of producing high solution images suitable for further morphometric analysis. Micro computed tomography has been applied to imaging hard tissue such as bone because of x-ray absorption in mineralized tissues.However, in the last decades, the use of Lugol's solution as a contrast agent has upgraded the application of using machine technique for soft tissues. This protocol combines procedures and tools using the field to demonstrate the great potential of micro computed tomography for studying the prenatal brains of small animals. The strength of our proposal, precisely depicting the process from the sample preparation to morphometric data processing.Images derived from micro computed tomography preserve a special information, which is difficult with standard histological techniques. Additionally, micro computed tomography with the use of a contrast agent has two advantages when compared with magnetic resonance. Scanners are less expensive and easy to operate and allow a higher spatial resolution.The protocol presented here could be applied with subtle modifications to fix samples of different organs derived from diverse species. Then a variety of scientific questions could be approached. Since the contrast agent is administered by emersion, the main limitations should be related to the sample size, but the potential applications are enormous.

染色されたマウス新生児脳サンプルのマイクロCTスキャン画像の処理

まず、画像処理ソフトウェアを起動し、ファイルを選択してからデータを開き、以前に生成されたドットBMP形式のマイクロCTスキャン画像を選択します。画像読み取りパラメータのウィンドウが開いたら、パラメータを確認し、正しければ受け入れます。メインパネルで、プロジェクトビューをクリックして、ドットBMPファイルの名前で作成された新しいオブジェクトを見つけます。作成したオブジェクトを右クリックし、オルソスライスオプションを選択し、作成をクリックします。プロパティ(properties)で、表示する方向平面とスライス番号を選択します。メインパネルで頭部全体の3Dボリュームを取得するには、プロジェクトビューに移動し、画像オブジェクトを右クリックし、インタラクティブなしきい値オプションを選択して、作成をクリックします。プロパティで、動物の頭部に対応する画像の部分が選択されるまで、最小しきい値RGBと最大しきい値RGBの値を変更します。次に、 [適用] を選択します。プロジェクトビューの下に作成された閾値オブジェクトを右クリックします。プロパティで等値面を選択し、サーフェスを可視化するしきい値を選択して、適用をクリックします。ランドマークをデジタイズするには、プロジェクトビューを右クリックし、オブジェクトの作成を選択し、ポイントとライン、ランドマークの順に選択して、作成をクリックします。次に、新しいオブジェクトのランドマークを右クリックします。ランドマークビューを選択し、作成をクリックします。[サイズ] で、ポイント サイズを変更します。プロパティにランドマークを追加するには、編集モードで [追加] を選択します。中脳皮質の交点にある次のランドマークまで曲線の周囲に均等に分布した 5 つのポイントをデジタイズし、皮質の周囲の 8 つの半ランドマークをデジタイズします。デジタイズされたポイントを保存するには、オブジェクトのランドマークを右クリックして[データの保存]を選択します。頭脳をセグメント化するには、プロジェクトビューを右クリックし、オブジェクトを作成してから、画像とフィールドを選択してから、フィールドにラベルを付けます。createをクリックします。ラベルフィールドオブジェクトを選択し、プロパティのセグメンテーションエディターオプションを押します。マテリアル(Materials)で、新しいマテリアルを追加し、名前を「brain」に変更します。選択で、現在のスライスを選択して、各スライスの脳に対応する組織をセグメント化します。ツールでは、魔法の杖とブラシを使用して、各スライスの脳組織を選択します。次に、選択の下で、追加を押します。プロジェクトビューに戻り、ラベルフィールドを右クリックして[サーフェスの生成]を選択し、[適用]をクリックします。サーフェスを取得したら、サーフェスの抽出を適用してエクスポートします。マイクロCTスキャンでは、新生児マウスの脳は小さいにもかかわらず、嗅球、皮質、中脳、小脳、後脳などの解剖学的構造を区別することができます。脳全体を手作業でセグメンテーションした結果、新生児の脳の3Dモデルが再構築されました。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Processing Micro-CT Scanned Image of Stained Murine Neonatal Brain Sample

Micro-CT Imaging and Morphometric Analysis of Mouse Neonatal Brains

Neuroimages are a valuable tool for studying brain morphology in experiments using animal models. Magnetic resonance imaging (MRI) has become the standard ...

神経科学

Murine Neonatal Brain Sample Fixation and Staining for Micro-CT Scanning

マイクロCTスキャンのためのマウス新生児脳サンプルの固定と染色