1 Börja med att utföraavbildning av enskilda molekyler i levande cell 2 av HaloTag-proteinkondensat. 3 Använd ImageJ för att konvertera varje kanal 4 från den råa bilddatafilen 5 till en oberoende TIFF-fil. 6 Om det behövs, kör förspårningskammen.
Text 7 och följ anvisningarna 8 för att ersätta alla ramar med de senaste. 9 För att ladda den enskilda molekylen av filmfilen i SlimFast, klicka 10 på ladda, följt av bildstapeln. 11 Ställ in parametrarna för lokalisering 12 och förvärv under respektive tillvalsblad.
13 Visualisera lokaliseringarna av alla molekyler. 14 Och med hjälp av lock all, 15 generera en fil som innehåller lokaliseringarna 16 av alla molekyler i varje ram. 17 Gå sedan till ladda partikeldata 18 och välj SlimFast för att ladda filen 19 med lokaliserings- och insamlingsinställningar.
20 Använd alternativ- och bladspårning för att justera parametrarna för generering av bana. 22 Klicka på gen traj för att generera en fil 23 som innehåller banorna för alla molekyler. 24 Ladda den spårade arkfilen i eval SPT 25 och ställ in parametrarna 26 för att filtrera bort banor som är kortare än 2,5 sekunder.
27 Använd exportdata för att generera en fil 28 med alla filtrerade banor. 29 Köra ImageJ-makrot, kärnan, 30 och klustermasken version två. text, 31 tröskel alla bildrutor i filmen som förvärvats 32 i JFX549-kanalen för att generera en time lapse-film 33 fylld med den tidsutvecklande binära masken 34 som markerar kondensatplatser.
35 Använda CSS för långsam spårning av konverterad ASCII 3. M, 36 formatera om banorna 37 och köra kategorisering version 4. M 38 för att sortera dem baserat på den livstid 39 som en molekyl tillbringar i ett kondensat.
40 Nästa, med hjälp av plot residence hist CSS. M, 41 extraherar den observerade dissociationshastigheten 42 för specifikt bundna molekyler 43 och fotoblekningshastigheten från det intressanta proteinet i kondensat 44 och H2B-banorna. 45 Beräkna slutligen den korrigerade genomsnittliga uppehållstiden 46 för proteinet av intresse, 47 specifikt bundet till dess kondensat.
48 En bildruta från tvåfärgsfilm 49 av TAF15 IDR-Halo-FTH1 visar signaler 50 från kärnan i både PA-JF646- och JFX549-kanalerna. 51 Vid montering och sortering observerades 52 en tydlig skillnad för de banor 53 av PA-JF646 detekterade molekyler bundna till kondensaten. 54 De beräknade genomsnittliga uppehållstiderna 55 efter korrigering för fotoblekning 56 var fler för TAF15-Halo-FTH1 än för Halo-TAF15.