click assay for the measurement of histone acetyltransferase 1 acetylation

تطوير مقايسة قائمة على النقر لفحص نشاط إنزيم HAT1

Among the numerous eukaryotic acetyltransferases, HAT1 was the initial histone acetyltransferase to be isolated1,2,3. Subsequent investigations have firmly established its pivotal role in chromatin replication, particularly in the synthesis of new nucleosomes during S-phase4. Our research endeavors led to the recognition that HAT1 is highly stimulated by epidermal growth factor (EGF) treatment in mammary cells5. Furthermore, it has come to light that HAT1 is required for rapid cell proliferation and tumor formation in vivo6,7,8,9. Data indicate that HAT1 is critical in coordinating anabolic and epigenetic processes for cell division, driving tumor growth.
HAT1 di-acetylates the amino-terminal tail of histone H4 on lysines 5 and 12 in complex with the chaperone protein Rbap46, which binds the histone and presents the amino-terminus to HAT1. Histone tetramers or disomes10, together with HAT1/Rbap46 and other histone chaperones11, are then imported to the nucleus. Histones are then released to be deposited at the replication fork, or other sites to support gene activation or repression. The function of the HAT1 di-acetylation mark on histone H4 is not fully understood. It is likely quickly removed within a span of 15-30 min by the action of histone deacetylases12,13,14,15 after H4 is inserted into chromatin. Thus, the HAT1 di-acetylation mark is not propagated in chromatin and may not serve a true epigenetic role, although a role in the recruitment of chromatin-modifying enzymes to nascent chromatin has been postulated12. Also, HAT1 does not directly acetylate chromatin; its activity is restricted to soluble histones.
The development of small-molecule histone acetyltransferase inhibitors has been hampered by nonspecific and low-throughput assays, often resulting in the generation of biologically reactive compounds16,17.&#160;The gold-standard assay to measure acetyltransferase activities requires the use of 3H-acetyl-coA, which limits throughput and requires radiation. Nonetheless, recently, specific and highly potent small molecule acetyltransferase inhibitors targeting CBP/p30018 and KAT6A/B19,20 have been described and confirmed through the use of 3H-acetyl-CoA. Moving forward, improved assays to achieve better throughput and avoid laboratory hazards are being devised.
Recent advances in acetylation monitoring21 have used click chemistry to enable enzymatic reaction monitoring. There are a variety of click-enabled precursors that are accessible by simple synthetic routes or available for purchase that can be incorporated into enzyme reactions. These reactions are typically carried out in recombinant systems, although cell-based assays are also feasible22. The advantage of click-enabled co-factors and substrates is that screening can directly measure enzyme activity without the need for coupled read-out systems that are often perturbed by screening compounds and require additional handling steps. This allows for inhibitor treatments only during the enzymatic step, whereas all downstream functionalization and detection steps are carried out after extensive washing to remove compounds, thus limiting the potential for assay interference to occur. These advantages make the design of click-enabled assays preferable to coupled assays that commonly rely on the detection of free coenzyme A.
One important consideration is the acceptance of click-enabled co-factors into the enzyme active site. Existing click-enabled co-factors may not be fully compatible with the active site optimized for the native co-factor. Structural information and modeling can be used to design amino acid substitutions to enlarge the active site to incorporate altered substrates23. This may enable screening with improved enzyme kinetics and lower substrate and enzyme levels. The drawback of this approach is that altered catalytic pockets may not identify inhibitors that interact strongly with the native enzyme. Ultimately, a combination of approaches is required to identify and validate potential enzyme inhibitors.
Here, we describe a method developed to purify and assay HAT1 enzyme activity using the click co-factor 4-pentynoyl-CoA24. This assay (Figure 1) uses the native enzyme sequence in complex with its required partner protein Rbap46, which has been shown to boost enzyme activity. Purification of the enzyme from human cells allows for enzyme activation in cellulo, which may preserve stimulating post-translational modifications important for full enzyme activity. Design and optimization of recombinant enzyme assays for high-throughput chemical screens have successfully been used to identify and characterize HAT1 small molecule inhibitors.

تسليط الضوء على المؤلف: تطوير مقايسة Acetyl-Click لفحص مثبطات HAT1

مقايسة كيميائية أسيتيل كليك لقياس هيستون أسيتيل ترانسفيراز 1 أسيتيل

Our developed acetyl-click assay serves as a tool to assess HAT1 acetyl transferase activity, which is key in isolating H4 histones before nucleosome incorporation. We aim to use this method for high throughput screening of small molecule inhibitors against the HAT1 enzyme. This method measures enzymatic activity directly on the peptide substrate.This offers advantages compared to other enzymatic assays by avoiding biologic variability and antibody related costs. This is also high throughput and can be adapted to use with other acetyl transferases. We have recently published a small molecule HAT1 inhibitor based on this assay that has activity in cells and animals.We continue to use this assay to screen additional chemical libraries and perform structure activity relationships. We are advancing methods to track histone production, folding, chaperoning, and chromatin integration. This highlights the need for improved chemical tools to explore biological mechanisms and stimulate drug discovery.Our goal is to demonstrate that targeting histone production can have therapeutic benefit for diseases such as cancer.

انقر فوق الفحص لقياس هيستون أسيتيل ترانسفيراز 1 أسيتيل

للبدء ، أعد تعليق الببتيد المركب الذي يعمل كعنصر تحكم إيجابي بتركيز 0.1 ملليغرام لكل ملليلتر في DMSO. امزج الببتيد المعاد تعليقه مع ببتيد هيستون H4 البيوتينيل لإنشاء منحنى قياسي. بعد ذلك ، قم بتجميع تفاعلات الأستيل في نسختين في 96 لوحة PCR جيدة.يجب أن يشتمل التفاعل الذي مقداره 20 ميكرولترا على 10 ميكرولترات من الإنزيم، وميكرولتر واحد من الببتيد H4، وميكرولتر واحد من المخزن المؤقت 20X، وميكرولتر واحد من DTT. أضف ميكرولترا واحدا من DMSO أو مركب الاختبار في كل بئر. ماصة بلطف الخليط لخلط.ثم احتضان الخليط على الجليد لمدة 10 دقائق للسماح لتعقيد مثبطات الإنزيم. لاستمرار تفاعل الأستيل ، اجمع بين ميكرولتر من الإنزيم المساعد لزيت 4-Penten A مع أربعة ميكرولترات من الماء. أضف ستة ميكرولتر من هذا الخليط إلى الآبار.بعد الخلط اللطيف ، قم بطرد الخليط عند 300 جرام لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة. احتضان المحتويات عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة في أنابيب مغطاة. قم بإخماد المحتويات ب 20 ميكرولترا من اليوريا ذات الثمانية مولات وتخزينها عند 20 درجة مئوية تحت الصفر حتى تتم المعالجة الإضافية.بعد ذلك ، ماصة 80 ميكرولتر من PBST في كل بئر من ألواح 96 بئرا السوداء المطلية مسبقا ب BSA NeutrAvidin. أضف 40 ميكرولترا من محتويات التفاعل إلى آبار اللوحة. ثم ماصة الببتيدات منحنى القياسية في نسختين في الآبار المتبقية.حرك الببتيدات برفق على شاكر مداري لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة لتسهيل الربط. بمجرد اكتمال الربط ، قم باستنشاق السائل من الآبار. استخدم غسالة الأطباق لغسل الآبار ب 200 ميكرولتر من PBST.لتفاعل النقر ، أضف خليط النحاس THPTA إلى أسكوربات الصوديوم في الماء وأزيد البيوتين في DMSO. قم بتوزيع 19 ميكرولتر من الكواشف المخلوطة حديثا في كل بئر. ختم اللوحة بورق الألمنيوم.ثم احتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. نضح الحل من الآبار قبل الغسيل كما كان من قبل. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من مزيج بيروكسيديز الفجل الستربتافيدين المخفف في كل بئر.احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة مع التحريض لطيف على شاكر المداري. للجمع بين كواشف الكشف Amplex Red ، ماصة 500 ميكرولتر من بيروكسيد الهيدروجين المخفف إلى كاشف Amplex Red. أضف 50 ميكرولترا من هذا الخليط إلى 4.5 ملليلتر من فوسفات الصوديوم.ماصة 100 ميكرولتر من خليط تفاعل Amplex Red إلى الآبار المغسولة. ثم احتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة بعيدا عن الضوء. قم بتشغيل برنامج SmartControl وانقر فوق Plate Out.بمجرد نقل اللوحة إلى الجهاز ، انقر فوق رمز Amplex Red وقم بتغيير تخطيط اللوحة. اضغط على أيقونة Amplex Red مرة أخرى لرؤية التخطيط الذي تم تغييره. ثم حدد الآبار القياسية العلوية اليسرى من التخطيط.قم بتغيير اسم الملف، ثم اضغط على بدء الضبط. بمجرد تعيين الكسب ، انقر فوق بدء القياس. اضغط على الحالة الحالية لمراقبة القياس في الوقت الفعلي.بمجرد انتهاء القياس ، أغلق علامة التبويب. ثم انقر فوق فتح آخر تشغيل في اللوحة العلوية. انتقل إلى علامة التبويب المريخ.ثم اضغط على تصدير إلى Excel من القائمة الرئيسية لتصدير نتائج البيانات. لوحظ أن المركبات A و C تمنع نشاط HAT1 بنسبة 100٪ تقريبا للعديد من التخفيفات.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Click Assay for the Measurement of Histone Acetyltransferase 1 Acetylation

An Acetyl-Click Chemistry Assay to Measure Histone Acetyltransferase 1 Acetylation

HAT1, also known as Histone acetyltransferase 1, plays a crucial role in chromatin synthesis by stabilizing and acetylating nascent H4 before nucleosome ...