stromal cell extraction from mouse bone and bone marrow for superior single cell multi&#45;omics data

Optimizing Stromal Cell Isolation from Thymus and Bone Marrow

In the healthy adult, de novo production of blood cells occurs in the bone marrow and the thymus. Stromal cells at these sites are essential for maintenance of hematopoiesis, but stroma constitutes less than 1% of the tissue1,2,3,4. Obtaining pure isolates of hematopoiesis supporting stroma therefore constitutes a significant challenge, particularly for single-cell multiomics that requires expedient processing to obtain samples of high quality. Components of different digestion cocktails may interfere with certain steps in multiomics analysis5,6. The protocols presented here detail the isolation of a wide variety of stromal cells from bone marrow and thymic tissues.
Perturbations of stromal constituents in both bone marrow and thymus result in profound disruption in blood cell development and can result in malignancies7,8,9. Hematopoiesis supporting stroma is damaged following cytotoxic conditioning and bone marrow transplantation, resulting in reduced secretion of cytokines and growth factors that sustain hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs)2,10,11. Furthermore, aging affects bone marrow and thymus stromal cells likely contributing to aged hematopoietic phenotypes. The thymus is the first organ to undergo extensive age-associated involution. Fat and fibrotic tissue start replacing T cell supportive stroma as early as the onset of puberty12,13. In the bone marrow, adipocyte content increases with age and the vascular and endosteal niches are significantly remodeled14,15,16.
To enable study of hematopoiesis supportive stroma across multiple stress states and in the case of the thymus of both human and murine tissue, we have optimized previously published digestion protocols1,2,8,17,18. These protocols ensure efficient and reproducible isolation of cells, and they are compatible with single-cell RNAsequencing (scRNAseq) and other types of multiomics.

Author Spotlight: Advancing Hematopoietic Research Using Stromal Cell Isolation for Single Cell Sequencing

Isolamento de células estromais de órgãos hematopoiéticos

Extração de células estromais de osso de camundongo e medula óssea para dados multiômicos superiores de célula única

Para começar, pegue os ossos do fêmur, tíbia, pelve e úmero isolados de um camundongo. Use um bisturi para cortar as placas de crescimento dos ossos longos, removendo a epífise. Coloque-o em um prato de 10 centímetros com meio M199 mais 2%FBS no gelo.Em seguida, use uma agulha de calibre 28 e uma seringa de 10 mililitros cheia de meio M199 mais 2% FBS para lavar a medula em um tubo de 15 mililitros no gelo. Coloque o osso lavado no prato com a epífise. Deixe o tubo de 15 mililitros na posição vertical no gelo até que a medula assente.Em seguida, remova o meio M199 mais 2% FBS Adicione quatro mililitros do coquetel de dissociação B & M ao tubo de 15 mililitros e incube em banho-maria a 37 graus Celsius. Após a incubação, colete o sobrenadante e filtre através de um filtro de células de 70 micrômetros em um tubo frio de 50 mililitros. Adicione dois mililitros de coquetel de dissociação B&M fresco ao pellet de medula óssea restante e retorne-o ao banho-maria.Usando uma pipeta de um mililitro, pipete vigorosamente todos os pedaços restantes de medula óssea. Colete todas as suspensões celulares no mesmo tubo de antes. Adicione 20 mililitros de meio M199 com 0,5% BSA e EDTA de dois milimolares à suspensão celular.Depois, centrifugue as células a 500 G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Ressuspenda o pellet em 500 microlitros de PBS com 0,5% de BSA e anticorpos de biotina. Incube em um agitador orbital por 10 minutos em temperatura ambiente no escuro.Em seguida, bata completamente as esferas magnéticas. Adicione 25 microlitros de grânulos ao tubo e incube novamente no agitador orbital. Coloque o tubo em um ímã correspondente por dois a três minutos e colete o sobrenadante em um tubo novo.Quebre os ossos em pedaços menores no prato de 10 centímetros usando a extremidade plana de um tubo de 50 mililitros. Filtre o sobrenadante através de um filtro de células de 70 micrômetros para isolar fragmentos ósseos. Corte os fragmentos ósseos no filtro de células com uma tesoura.Coloque o filtro com os fragmentos ósseos em um tubo de 50 mililitros e abra o filtro com o bisturi. Com uma pinça, transfira a fração óssea para cinco mililitros de mistura de dissociação murina B&M. Em seguida, coloque o tubo horizontalmente em banho-maria a 37 graus Celsius com agitação de 120 RPM por 30 minutos.Após a digestão, adicione 25 mililitros de meio M199 com 0,5% BSA e EDTA de dois milimolares. Filtre o sobrenadante contendo células estromais através de um filtro de células de 70 mícrons em um tubo frio de 50 mililitros.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Stromal Cell Extraction from Mouse Bone and Bone Marrow for Superior Single Cell Multi&#45;Omics Data

Stromal Cell Isolation From Hematopoietic Organs

Single-cell sequencing has enabled the mapping of heterogeneous cell populations in the stroma of hematopoietic organs. These methodologies provide a lens ...

Imunologia e Infecção

Isolation of Stromal Cells from Murine Thymic Tissue for Generating High&#45;Quality Single Cell Multiomics Datasets

Isolamento de células estromais de tecido tímico murino para geração de conjuntos de dados multiômicos de célula única de alta qualidade