Para comenzar, tome el tejido de cáncer de ovario recién aislado. Lave bien el pañuelo fresco en una placa de Petri con PBS sin calcio ni magnesio. Con bisturíes y tijeras desechables, fragmente el tejido de la placa de Petri en trozos pequeños.
Recolectar el tejido en tubos criogénicos. Luego, transfiera estos tubos a un recipiente lleno de nitrógeno líquido para congelarlos por choque. A continuación, recoja tejido que mida de dos a tres milímetros en un recipiente de muestras histológicas y luego fije el tejido en un recipiente de formol durante 24 horas.
Utilice un bisturí para homogeneizar el tejido antes de la digestión enzimática para maximizar la disociación mecánica. Luego, incubar en un baño de agua a 37 grados centígrados durante 1,5 horas. Después de la incubación, introducir 15 mililitros de medio de cultivo basal frío en el tubo.
Centrifugar el tubo durante cinco minutos a 300 G, retirar el sobrenadante y añadir cinco mililitros de nuevo medio de cultivo basal. Luego, cuele la suspensión celular con un filtro de 400 micrómetros en un tubo nuevo de 15 mililitros. Para eliminar los eritrocitos, agregue cinco mililitros de tampón de lisado de glóbulos rojos al gránulo celular e incube en un baño de agua durante cinco minutos a 37 grados centígrados.
Después de la incubación, agregue cinco mililitros de medio basal para la inactivación de la lisis. Granular las células por centrifugación y añadir tres mililitros de medio de cultivo basal al gránulo celular. Ahora transfiera el número requerido de células suspendidas en el medio de cultivo basal a un nuevo tubo.
Centrifugar las células y, después de desechar el sobrenadante, mezclar bien el gránulo celular con la matriz fría de BME 2 en hielo. Siembre las células en gotas de la matriz BME 2 en una placa vacía de 48 pocillos precalentada mientras pipetea entre medias para garantizar una distribución uniforme. A continuación, agregue 250 microlitros de cada medio para el cáncer de ovario en los pocillos correspondientes.
Para iniciar un cultivo 2D a partir de las células aisladas restantes, centrifugue las células durante cinco minutos a 300 G y agregue el gránulo celular al medio 2D. Utilice un microscopio de contraste de fase para obtener imágenes de alta calidad de cultivos 2D y 3D, así como de placas de visualización directa. Imagine la placa bajo el objetivo 4X para obtener una visión general de los pocillos y bajo los objetivos 10X y 20X para documentar la morfología de los organoides.
Organice y almacene las imágenes en carpetas dedicadas a líneas individuales. Aproximadamente de 14 a 21 días después del aislamiento, evalúe el potencial de formación de organoides, incluida la cantidad, el tamaño y el fenotipo celular. Busque características específicas como la ausencia de vacuolas, el desprendimiento de la membrana, la pérdida de adhesión y el redondeo de las células.
Se generaron con éxito líneas de organoides a partir de diferentes tipos histológicos y estadios del cáncer de ovario, incluidas las cirugías serosas primarias de alto grado, las cirugías de intervalo posneoadyuvantes y la enfermedad recurrente.
