fluorescence micropipette aspiration assay to study live cell rbc mechanosensing

Механобиология одиночных клеток с использованием аспирации флуоресцентных микропипеток

The unfolding discoveries in the world of cellular behaviors have accentuated the role of mechanical stimuli, such as tension, fluid shear stress, compression, and substrate stiffness, in dictating dynamic cellular activities such as adhesion, migration, and differentiation. These mechanobiological aspects are of paramount importance in elucidating how cells interact with and respond to their physiological environments, impacting various biological processes1,2.
Over the past decade, micropipette-based aspiration assays have stood out as a versatile tool in studying diverse cellular responses to mechanical stimuli. This technique offers valuable insights into the intrinsic mechanical properties of living cells at the single-cell level, including cellular elastic modulus, stiffness, and cortical&#160;tension. These assays enable the measurement of various mechanical parameters, such as cell membrane&#160;tension, pressure exerted on the cell membrane, and cortical tension (summarized in Table 1). Studying the aspirational forces has enriched our understanding of how they influence cellular functions and processes, particularly in the realm of membrane dynamics, including fragmentation, elongation, and budding3,4.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mechanical Parameter</td>
			<td>Description</td>
			<td>Seminal Approaches</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Stiffness</td>
			<td>Measurement of a cell&#39;s mechanical rigidity and elasticity.</td>
			<td>Aspiration of the cell membrane and analysis of deformation response to the negative pressure20,21.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesion Strength</td>
			<td>Evaluation of how strongly cells adhere to surfaces.</td>
			<td>Application of controlled suction to detach adhered cells from a substrate2,22.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane Tension</td>
			<td>Assessment of the tension or stress within cell membranes.</td>
			<td>Measurement of the membrane deformation in response to applied pressure23,24.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viscoelastic Properties</td>
			<td>Characterization of a cell&#39;s combined viscous and elastic behavior.</td>
			<td>Analysis of the time-dependent deformation response to aspiration23,25.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deformability</td>
			<td>Determination of how easily a cell can change shape.</td>
			<td>Evaluation of the extent of deformation under controlled suction20,24.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surface Tension</td>
			<td>Measurement of the tension at the cell&#39;s surface.</td>
			<td>Assessment of the pressure required to form a micropipette membrane protrusion26.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Material Interaction</td>
			<td>Study of interactions between cells and materials or substrates.</td>
			<td>Aspiration of cells in contact with different materials and observation of interactions2,24.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Cell Interaction</td>
			<td>Examination of interactions between neighboring cells.</td>
			<td>Aspiration of a group of cells and analysis of their intercellular forces27.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1: Mechanical parameters characterized by the micropipette aspiration assay.
The micropipette-based aspiration technique has been widely used to study red blood cells (RBCs), assessing the deformability and various mechanical characteristics of RBCs, which is essential in understanding their function in the circulatory system. RBCs exhibit remarkable adaptability, preserving their mechanical versatility against deformation when navigating through the intricate capillary network and inter-endothelial clefts5,6. During this journey, RBCs must traverse through passages as narrow as 0.5-1.0 &#181;m, subjecting themselves to a multitude of mechanical forces, including tension and compression7,8,9. They also have high sensitivity to the shear stress generated by blood flow during circulation10. These processes promote the activation of regulatory mechanisms involving calcium influx, a crucial signaling event with well-established roles in cellular responses to mechanical stimuli11,12. The complex mechanisms governing the calcium-mediated mechanosensing remain compelling subjects of ongoing investigation.
In this context, the fMPA stands as an effective approach to reveal the extent of calcium mobilization under precisely controlled mechanical forces, allowing for the simultaneous application of mechanical modulation (using the micropipette aspiration system) and visualization of calcium intensity (using fluorescent indicators). It particularly mimics the physiological scenario when the RBC travels through narrowing blood vessels. It is worth noting that the fMPA system we developed can generate pressure with a resolution of 1 mmHg. The implemented high-speed camera can achieve a temporal resolution of 100 ms and a spatial resolution at the submicron-meter level. These configurations ensure the precise application of mechanical forces to live cells and simultaneously capture the resulting cellular signaling. Moreover, due to the integrative engineered nature of this setup, the micropipette aspiration assay can be readily adapted to complement other equipment or techniques, enabling further exploration of the intricacies of cell mechanics. This versatility stands as an additional advantage of this approach.

В центре внимания автора: Развитие механобиологии живых клеток с помощью флуоресцентной микроаспирации

Аспирационный анализ флуоресцентной микропипетки для исследования механочувствия эритроцитов

The scope of our research is directed towards lifestyle mechanobiology, specifically the behavior of cells where mechanical stress is applied. We are investigating the intracellular signaling in single cells. The proposed FMPA system utilizes fluorescence imaging combined with mechanical stimuli.That is, the aspiration pressure. There are currently further advancements that have attempted to combine more than two techniques with the microaspiration setup like microfluidics or image analysis software. Current experimental challenges lie with the fact that the setup is quite labor intensive and is operator dependent.As the system is manually operated, there are inconsistencies that arise in specific steps. For example, filament preheating. The findings of research demonstrated there was a corresponding increase in the influx of calcium ions into the RBCs when the pressure was incrementally increased between negative 10 millimeter mercury to negative 40 millimeter mercury.This suggests that RBCs poses the ability to sense changes in their mechanical environment and respond by rapid calcium-related channel activities. This study places particular emphasis on the application of FMPA as a crucial tool for unveiling the nuanced mechanosensitive responses showcased by RBCs under varying stimuli.

Флуоресцентный аспирационный анализ микропипеток для изучения механосенсорики эритроцитов живых клеток

Для начала с помощью алмазного карандаша разделите стандартную стеклянную крышку на три равные полоски. Используйте вакуумную смазку, чтобы приклеить кусок скользящей полосы крышки к нижней части самодельного держателя камеры. Аналогичным образом прикрепите вторую часть накладки крышки к верхней части держателя патронника.Затем с помощью пистолета-пипетки введите 200 микролитров меченой суспензии эритроцитов между двумя покровными стеклами. Для сборки аспирационной установки микропипетки установите клеточную камеру на столик держателя на платформе микроскопа. Отрегулируйте положение камеры так, чтобы она оказалась прямо под объективом.Теперь опустите держатель до тех пор, пока он не опустится ниже уровня жидкости подключенного резервуара для воды. Введите деминерализованную воду в микропипетку, затем используйте шприц, оснащенный иглой 34-го калибра, чтобы удалить пузырьки воздуха. Отвинтите конец держателя микропипетки наполовину и дайте воде стечь с держателя в течение нескольких секунд.Затем вставьте заполненную суспензией микропипетку в наконечник держателя и затяните винт держателя. Поместите микропипетку в камеру клетки. Затем расположите пипетку и эритроциты под микроскопом.Опустите наконечник пипетки, чтобы убедиться, что он находится на одном уровне с расположенными эритроцитами. Отрегулируйте высоту резервуара для воды, чтобы обнулить гидравлическое давление на наконечнике. Затем слегка поднимите резервуар для воды, чтобы создать небольшое положительное давление.Включите 488-нанометровый флуоресцентный источник возбуждающего света. Включите люминесцентную камеру и передаваемую камеру. Введите время экспозиции, область интереса и размер биннинга для обеих камер в соответствующем программном обеспечении.Затем установите номер сбора на 2000 на панели Multi-Dimensional Acquisition. Выберите нужную папку сохранения. Затем найдите микропипетку с помощью микроманипулятора.Включите пневматический прижимной зажим и убедитесь, что блок управления находится во внешнем режиме. Медленно поворачивайте ручку, чтобы компенсировать любое смещение давления внутри системы. Запустите программное обеспечение, управляющее пневматическим зажимом.Используйте электрическую панель управления, чтобы контролировать давление с коэффициентом преобразования ртути 20 милливольт на миллиметр. Теперь обнулите давление внутри системы, затем осторожно переместите микропипетку рядом с эритроцитами. Отрегулируйте положение резервуара для воды, чтобы создать небольшое положительное давление на кончике микропипетки.Запустите съемку в программном обеспечении камеры и включите флуоресцентный затвор. Введите рассчитанную величину напряжения в панель управления, чтобы достичь желаемого давления и аспирировать эритроциты. Удерживайте давление в течение заданного времени, затем отпустите его.Аналогично повторите эксперимент со следующим эритроцитом перед дальнейшим анализом. Постепенное повышение давления приводило к повышенной мобилизации ионов кальция в эритроциты.

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence Micropipette Aspiration Assay to Study Live Cell RBC Mechanosensing

Fluorescence Micropipette Aspiration Assay to Investigate Red Blood Cell Mechanosensing

Micropipette aspiration assays have long been a cornerstone for the investigation of live-cell mechanics, offering insights into cellular responses to ...

Fabrication of Micropipettes for Fluorescence Aspiration Assay to Study Live Cell RBC Mechanosensing

Изготовление микропипеток для флуоресцентного аспирационного анализа для изучения механосенсорики эритроцитов живых клеток