modeling phosphoenolpyruvate in enolase enzyme from mycobacterium tuberculosis

Modellierung von niedermolekularen Liganden in KryoEM-Karten von Makromolekülen

Cells accomplish their functions by carrying out innumerable chemical reactions simultaneously and independently, each meticulously regulated to ensure their survival and adaptability in response to environmental cues. This is achieved by molecular recognition, which enables biomolecules, especially proteins, to form transient or stable complexes with other macromolecules as well as small molecules or ligands1. Thus, protein-ligand interactions are fundamental to all processes in biology, which include the regulation of protein expression and activity, the recognition of substrates and cofactors by enzymes, as well as how cells perceive and relay signals1,2. A better understanding of the kinetic, thermodynamic, and structural properties of the protein-ligand complex reveals the molecular basis of ligand interaction and also facilitates rational drug design by optimizing drug interaction and specificity. An economical and faster approach to studying protein-ligand interaction is to use molecular docking, which is a computational method that virtually screens a diverse range of small molecules and predicts the binding mode and affinity of these ligands to target proteins3. However, experimental evidence from high-resolution structures determined by X-ray Diffraction (XRD), Nuclear Magnetic Resonance (NMR), or electron cryomicroscopy (cryoEM) provides the essential proof for such predictions and aids in the development of newer and more effective activators or inhibitors for a given target. This article uses the abbreviation &#39;cryoEM&#39; as the technique is commonly referred to. However, there is an ongoing debate on choosing the correct nomenclature, and recently, the term cryogenic-sample Electron Microscopy (cryoEM) has been proposed to indicate that the sample is at cryogenic temperature and imaged with electrons4. Similarly, the maps derived from cryoEM have been called electron potential, electrostatic potential, or Coulomb potential, and for simplicity, here we use cryoEM maps5,6,7,8,9,10.
Although XRD has been the gold standard technique in high-resolution structure determination of protein-ligand complexes, post resolution-revolution11 cryoEM has gained momentum, as indicated&#160;by the surge of Coulomb potential maps or cryoEM maps deposited in the Electron Microscopy Database (EMDB)12,13 over the last few years14. Owing to advancements in sample preparation, imaging, and data processing methods, the number of Protein Data Bank (PDB)14 depositions employing cryoEM increased from 0.7% to 17% between 2010 and 2020, with approximately 50% of reported structures in 2020 being determined at 3.5&#8197;&#197; resolution or better15,16. CryoEM has been rapidly adopted by the structural biology community, including the pharmaceutical industry, as it allows the study of flexible and non-crystalline biological macromolecules, especially membrane proteins and multi-protein complexes, at near-atomic resolution, overcoming the process of crystallization and obtaining well-diffracting crystals required for high-resolution structure determination by XRD.
Accurate modeling of the ligand in the cryoEM map is paramount, as it serves as a blueprint of the protein-ligand complex at a molecular level. There are several automated ligand-building tools used in X-ray crystallography&#160;that depend on the shape and topology of the ligand density in order to fit or build the ligand into the electron density17,18,19,20. Nevertheless, if the resolution is lower than 3 &#197;, these approaches tend to produce less desirable outcomes because the topological features on which they depend for recognition and building become less defined. In many instances, these methods have proven ineffective in accurately modeling ligands into cryoEM maps, as these maps have been determined in the low-to-medium resolution range, typically between 3.5 &#197;-5 &#197;17.
The first step in 3D structure determination of a protein-ligand complex by cryoEM involves either co-purifying the ligand with the protein (when the ligand has a high binding affinity to the protein) or incubating the protein solution with the ligand for a specific duration before grid preparation. Subsequently, a small sample volume is placed onto a plasma-cleaned holey TEM grid, followed by flash freezing in liquid ethane and ultimately imaging with a cryo-TEM. The 2D projection images from hundreds of thousands to millions of individual particles are averaged to reconstruct a 3-dimensional (3D) Coulomb potential map of the macromolecule. Identifying and modeling ligands and solvent molecules in these maps pose significant challenges in many cases due to the anisotropic resolution across the map (i.e., the resolution is not uniform across the macromolecule), flexibility in the region where the ligand is bound, and the noise in the data. Many of the modeling, refinement, and visualization tools that were developed for XRD are now being adapted for use in cryoEM for the same purposes18, 19, 20, 21. In this article, an overview of various methods and software currently used to identify ligands, build models, and refine the coordinates derived from cryoEM is presented. A step-by-step protocol has been provided to illustrate the processes involved in modeling ligands using specific protein-ligand complexes with varying resolution and complexity.
The first step in modeling ligands in cryoEM maps includes the identification of the ligand density (non-protein) in the map. If ligand binding does not induce any conformational change in the protein, then calculating a simple difference map between the protein-ligand complex and the apo-protein essentially highlights the regions of extra density, suggesting the presence of the ligand. Such differences can be observed immediately, as it just requires two maps, and even intermediate maps during the process of 3D refinement can be used to check if the ligand is present. Additionally, if the resolution is high enough (&#60;3.0 &#197;), then the difference map can also provide insights into the location of water molecules as well as ions interacting with the ligand and the protein residues.
In the absence of the apo-protein map, it is now possible to use Servalcat22, which is available as a standalone tool and has also been integrated into the CCP-EM software suite23,24 as part of the Refmac refinement and in CCP4 8.0 release25,26. Servalcat allows the calculation of an FSC weighted difference (Fo-Fc) map using the unsharpened half-maps and the apoprotein model as input. The Fo-Fc omit map represents the disparity between the experimental map (Fo) and the map derived from the model (Fc). In the absence of a ligand in the model, a positive density in a Fo-Fc map that overlaps with the experimental EM map typically suggests the presence of the ligand. The assumption here is that the protein chain is well-fitted in the map, and the remaining positive density indicates the location of the ligand. However, it is important to meticulously examine whether the positive density stems from modeling inaccuracies, such as the wrong rotamer of a protein side-chain.
The second step involves obtaining or creating a cartesian coordinate file of the ligand with well-defined geometry from the available chemical information. Standard ligands (for example, ATP and NADP+) that are already available in the CCP4 monomer library can be used for refinement by retrieving the coordinate and geometry files via their monomer accession code. However, for unknown or non-standard ligands, various tools are available to create the geometry files. Some of the examples include the eLBOW27 - (electronic ligand builder and optimization workbench) in Phenix28, Lidia - an in-built tool in Coot29, JLigand/ACEDRG30,31, CCP-EM23,24, Ligprep32-a module of Glide within the Schrodinger suite. The ligand coordinate file is then fitted in the density, guided by both the experimental cryoEM map and the difference map in Coot. This is followed by real-space refinement in Phenix28 or reciprocal refinement in Refmac33. A Linux workstation or a laptop equipped with a good graphics card and the above-mentioned software is required. Most of these programs are included in various suites. CCP-EM24&#160;and Phenix28 are freely available to academic users and include a variety of tools that are used in this article, including Coot, Refmac533,34,35,36, Servalcat, phenix.real_space_refine, etc. Similarly,&#160;Chimera37, and ChimeraX38 provide free licenses to academic users.

Autor im Rampenlicht: Erforschung zellulärer Prozesse durch Modellierung von Liganden in Kryo-EM-Karten

Modellierung von Liganden in Karten aus der Elektronenkryomikroskopie

We are interested in understanding the physiological processes that occur across the cell, particularly at the membrane interface. We use Cryo-EM as a main technique and work on various interesting and challenging biological problems studying multiple macromolecular complexes. Determining the structures of membrane proteins and other labile complexes was challenging couple of decades ago.However, technical advances in Cryo-EM, a novel detergent and lipid mimetic and with endowments paved the way for rapid structure determination of these complexes. These structures can now be obtained at high resolution and potentially used in drug discovery. In single particle Cryo-EM, challenges include acquiring stable and homogeneous sample, embedding the sample in random orientation in thin ice, processing a large number of images with low signal to noise ratio, and accurately determining the angular orientation and classification during 3D reconstruction.Identifying and modeling small molecules in cryo-EM maps of ligand protein complexes is challenging due to inherent noise in the data and isotropic and low map resolution, sample heterogeneity, and ligand flexibility. This protocol is a step-by-step guide for identifying and modeling ligands and solvent molecules in low to medium resolution Cryo-EM.

Modellierung von Phosphoenolpyruvat im Enolase-Enzym aus Mycobacterium tuberculosis

Beginnen Sie mit dem Herunterladen der ungeschärften Halbkarten der Apo-Enolase aus zusätzlichen Daten in EMDB. Öffnen Sie dann ChimeraX und klicken Sie in der Symbolleiste auf Öffnen. Wählen Sie die halben Karten der Apo-Enolase aus.Geben Sie dies in die Befehlszeile ein, um die halben Maps zu kombinieren und die unscharfe Apo-Enolase-Map zu erhalten. Stellen Sie den Schwellenwert der Karte auf 0,0595 ein, um das Rauschen zu reduzieren. Geben Sie dann diesen Befehl ein, um die kombinierte Karte umzubenennen.Klicken Sie auf Öffnen. Wählen Sie die PEP enolase unscharfen Halbzuordnungen aus und geben Sie diesen Befehl in die Befehlszeile ein. Passen Sie den Schwellenwert des Maps auf 0,0721 an, um das Rauschen zu reduzieren, und benennen Sie das Map um.Zeigen Sie dann die ungeschärften Apo-Enolase- und PEP-Enolase-Maps an und klicken Sie im Map-Panel auf Anpassen, um eine Differenzkarte zu berechnen. Geben Sie diesen Befehl in die Befehlszeile ein, um die PEP-Enolase-Map von der Apo-Enolase-Map zu subtrahieren und den Schwellenwert anzupassen. Färbe die subtrahierte Karte grün ein, was eine positive Dichte angibt.Öffnen Sie als Nächstes PDB und laden Sie die Koordinaten von mycobacterium tuberculosis octameric enolase herunter. Klicken Sie dann in ChimeraX in der Symbolleiste auf Öffnen und wählen Sie den Dateinamen aus. Klicken Sie auf Molekülanzeige, Atome ausblenden und Cartoon anzeigen.Geben Sie diesen Befehl ein, um das Modell umzubenennen. Wählen Sie das Modell in der Gruppe Modell aus. Klicken Sie mit der rechten Maustaste in der Symbolleiste.Klicken Sie dann auf Modell verschieben, und positionieren Sie das Modell in der Nähe der PEP-Enolase-Map. Richten Sie das Modell in Bezug auf die Karte aus. Passen Sie dieses Modell in die unscharfe PEP-Enolase-Karte ein, indem Sie diesen Befehl in die Befehlszeile eingeben.Überprüfen Sie die Passform. Passen Sie die Farb- und Strukturdarstellung an. Öffnen Sie Coot über das Terminal, indem Sie coot&Click on File (Datei) eingeben, dann Open Coordinates (Koordinaten öffnen) und Apo-enolase.pdb auswählen.Laden Sie als Nächstes die PEP-gebundene Enolase-Sharpened-Map von EMDB herunter. Zeigen Sie diese Karte in Coot an, indem Sie auf Datei und Karte öffnen klicken. Scrollen Sie mit der mittleren Maustaste, um den Schwellenwert auf 7,00 Sigma einzustellen.Klicken Sie auf Validieren und dann auf Nicht modellierte Blobs. Geben Sie im neuen Fenster 7.00 als RMSD ein, und klicken Sie auf Blobs suchen. Lokalisieren Sie die nicht modellierte Ligandendichte in der Nähe der Reste des aktiven Zentrums, Serin 42, Lysin 386 und Arginin 364.Klicken Sie anschließend auf Datei, Monomer abrufen und geben Sie PEP ein, um die PEP-Monomer-Modelldatei aus der Coot Monomer-Bibliothek zu erhalten. Verschieben Sie das PEP-Molekül auf die Dichte, indem Sie die Option "Zonenkettenmolekül drehen" im Seitenleistenmenü verwenden. Klicken Sie dann in der Seitenleiste auf Real Space Refined Zone, um das PEP-Molekül in die Dichte einzupassen.Bewerten Sie die Passform und klicken Sie auf Akzeptieren, wenn Sie fertig sind. Verwenden Sie die Option Merge Molecule auf der Registerkarte Bearbeiten, um den angepassten Liganden mit dem Apo-Enolase-Modell zusammenzuführen und das Modell als PEP enolase.pdb zu speichern. Klicken Sie dann auf Berechnen, NCS-Werkzeuge, gefolgt von NCS-Liganden, um Liganden zu den restlichen Monomeren in der Koordinatendatei hinzuzufügen.Wählen Sie für das Protein mit NCS-Option die Koordinatendatei Apo-Enolase. pdb und Ketten-ID A als NCS-Master-Kette. Wählen Sie als Nächstes für das Molekül, das den Liganden enthält, Apo-Enolase.pdb als Koordinatendatei, die Ketten-ID J und die Restnummer 121. Klicken Sie auf Kandidatenstellen suchen. Klicken Sie auf die einzelnen Kandidatenliganden und analysieren Sie die Passung visuell.Modellieren Sie dann zwei Magnesiumionen in der Dichte des aktiven Zentrums, indem Sie am Zeiger auf Atom platzieren klicken und MG aus der Liste Zeigeratomtyp auswählen. Fügen Sie außerdem die Magnesiumionen in die symmetriebezogenen Monomere ein. Beurteilen Sie die Passung für die symmetriebezogenen Magnesiumatome.Speichern Sie das Modell, indem Sie auf Datei und dann auf Koordinaten speichern klicken. Wählen Sie den Dateinamen aus und geben Sie enolase plus PEP plus MG.pdb ein. Öffnen Sie dann die Phoenix-GUI.Führen Sie einen realen Speicherverfeinerungsauftrag mit Standardparametern mit dem gespeicherten Modell und der PEP-gebundenen geschärften Karte aus. Um den modellierten Liganden zu visualisieren, öffnen Sie PyMOL, klicken Sie auf Datei und dann auf Öffnen, um das verfeinerte Modell aus dem Phoenix-Verfeinerungsauftrag zu laden. Laden Sie auch die PEP-gebundene Sharpened Map.Benennen Sie die Map in PEP sharpened um, indem Sie auf Aktionen und dann auf Umbenennen klicken. Wählen Sie dann die Liganden aus, indem Sie auf Anzeige und dann auf Sequenz klicken. Geben Sie diese in die Befehlszeile ein und drücken Sie die Eingabetaste.Dadurch wird die Map-Dichte um die Auswahl herum geschnitzt. Klicken Sie auf das letzte Feld C, neben dem mesh_ligand Objekt, um die Farbe des Ligandennetzes in Blau zu ändern. Zeigen Sie die Reste des aktiven Zentrums an, die mit den PEP- und Magnesiumionen in der Stick- und Kugeldarstellung und dem Enolase-Enzym in der Cartoon-Darstellung interagieren.Legen Sie die Maschenweite fest. Geben Sie diese in die Befehlszeile ein, um Raytracing durchzuführen und das Bild als PNG-Datei zu speichern. Während der Glykolyse wandelt Enolase zwei Phosphoglycerat in Phosphoenolpyruvat um, ein wichtiges Zwischenprodukt für verschiedene Stoffwechselwege.Die Differenzkarte des Apo-Enzyms und des PEP-gebundenen Enzyms zeigte eine deutliche Ligandendichte. Außerdem wurde eine zusätzliche Dichte im aktiven Zentrum des modellierten Proteins beobachtet. Phosphoenolpyruvat und zwei Magnesiumionen wurden in der Dichte modelliert, die in der Nähe des Liganden beobachtet wurde.Phosphoenolpyruvat bildete Wasserstoffbrückenbindungen mit mehreren Resten des aktiven Zentrums, wie Lysin 386 und Arginin 364. Die Magnesiumionen bildeten metallische Koordinationsbindungen mit Aspartat 241, Glutamat 283, Aspartat 310 und dem Phosphat von Phosphoenolpyruvat.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Modeling Phosphoenolpyruvate in Enolase Enzyme from Mycobacterium tuberculosis

210 Views. Begin by downloading the unsharpened half-maps of the apo-enolase from additional data in EMDB. Then open ChimeraX and click on Open in the toolbar. Select the half-maps of apo-enolase.Type this in the command line to combine the half-maps and obtain the apo-enolase unsharpened map. Adjust the threshold of the map to 0.0595 to reduce noise. Then type this command to rename the combined map.Click on Open. Select the PEP enolase unsharpened half-maps and type this command in the c...