differentiation of enteric neural crest spheroid and neuronal induction from human pluripotent stem cells for enteric nervous system research

Derivation of Enteric Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

The enteric nervous system (ENS) is the largest component of the peripheral nervous system. The ENS contains more than 400 million neurons that are located within the GI tract and control nearly all functions of the gut1. Molecular understanding of the ENS development and function and its defects in enteric neuropathies requires access to a reliable and authentic source of enteric neurons. Access to human primary tissue is limited, and animal models fail to recapitulate key disease phenotypes in many enteric neuropathies. Human pluripotent stem cell (hPSC) technology has proven exceedingly beneficial in providing an unlimited source of desired cell types, especially those that are difficult to isolate from primary sources2,3,4,5,6,7. Here, we provide details of a stepwise and robust in vitro method to obtain ENS cultures from hPSCs. These scalable hPSC-derived cultures open avenues for developmental studies, disease modeling, and high-throughput drug screening and can provide transplantable cells for regenerative medicine.
Enteric neuron lineages are derived from neural crest (NC) cells following the ENS developmental path during embryogenesis. In embryos, NC cells emerge along the margins of the folding neural plate. They proliferate, migrate and give rise to many different cell types including sensory neurons, Schwann cells, melanocytes, craniofacial skeleton and enteric neurons and glia8,9,10. The cell fate decision depends on the distinct region along the anterior-posterior axis that the NC cells emerge from, i.e., cranial NC, vagal NC, trunk NC and sacral NC. The ENS develops from vagal and sacral NC cells with the former dominating the population of the enteric neurons owing to the extensive migration along the length of the bowel and colonizing the gut11.
Derivation of NC cells from PSCs commonly involves a combination of dual SMAD inhibition and WNT pathway activation12,13. Until recently, all NC induction protocols involved serum and other animal product additives in the culture conditions. Chemically undefined media not only lower the reproducibility of NC induction but also challenge mechanistic developmental studies. To overcome these challenges, Barber et al14 developed an NC induction protocol using chemically defined culture conditions and was hence advantageous over alternative methods that rely on serum-replacement factors (e.g., KSR)13,14. This was obtained by basal media replacements and optimizing a protocol originally presented by Fattahi et al to derive enteric NC cells from hPSCs. This improved system is the basis of the hPSC differentiation protocol that is presented here. It begins with induction of enteric neural crest (ENC) cells in a 15-day period by precise modulation of BMP, FGF, WNT and TGF&#946; signaling in addition to retinoic acid (RA). We then derive the ENS lineages by treating cells with glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF). All media compositions are chemically defined and yield robust enteric neuronal cultures within 30-40 days.
In addition to the monolayer cell culture system described here, alternative NC induction approaches have been developed which use free-floating embryoid-bodies15,16. Migratory cells in these cultures have been shown to express NC markers with a subset representing the vagal NC. Co-cultures with primary gut tissue have been used to enrich enteric NC precursors in these cultures. Media compositions in these studies contain a combination of different factors such as nerve growth factor, NT3 and brain-derived neurotrophic factor. At this stage, it is not fully clear how these factors might affect the enteric neuron precursor commitment identities. For an efficient comparison of the enteric NC induction in the monolayer and the embryoid-body-based cultures more data is required. Given the different culture layouts in these strategies, the use of each method should be considered and optimized according to specific application in mind.
The protocol presented here is reproducible and has been successfully tested by us and others using different hPSC (induced and embryonic) lines8,14,16.

Author Spotlight: Robust Culture of Human Enteric Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Differentiation of Enteric Nervous System Lineages from Human Pluripotent Stem Cells(인간 만능줄기세포와 장 신경계 계통의 분화)

장 신경계 연구를 위한 인간 만능 줄기 세포에서 장 신경 크레스트 스페로이드 및 신경 유도의 분화

먼저, 신경능선 유도(neural crest induction)를 받은 인간 만능줄기세포(human pluripotent stem cell)를 12일 동안 배양합니다. 세포에서 배지 C를 부드럽게 흡입합니다. 웰 표면적의 평방 센티미터당 100마이크로리터의 PBS를 추가하여 세포를 세척한 다음 PBS를 제거합니다.세포에 동일한 부피의 세포 분리 용액을 추가하고 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소 보충 하에 30분 동안 배양합니다. 플레이트에 동일한 부피의 NCC 매체를 추가합니다. 그런 다음 혈청학적 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 채취하고 15밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다.섭씨 20도에서 25도 사이에서 290G에서 2분 동안 셀을 회전시킵니다. 세포 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 버리십시오. 10밀리리터 혈청학적 피펫을 사용하여 세포 펠릿에 12밀리리터의 NCC 배지를 피펫팅합니다.서스펜션을 위아래로 기계적으로 피펫팅하여 서스펜션을 만듭니다. 그런 다음 셀 현탁액을 초저 부착 플레이트로 옮깁니다. 14일째에는 세포 배양 플레이트를 부드럽게 소용돌이쳐 각 웰 중앙에 작은 스페로이드를 모읍니다.P1000 마이크로 피펫을 사용하여 각 웰의 둘레에서 사용된 매체를 천천히 흡입합니다. NCC 배지의 원래 부피로 세포를 다시 공급합니다. 15일째 되는 날에 배지를 조심스럽게 제거합니다.스페로이드를 세척하기 위해 웰에 PBS를 추가합니다. 그런 다음 가능한 한 많은 PBS를 제거하여 스페로이드가 방해받지 않도록 합니다. 다음으로, 웰 표면적의 평방 센티미터당 100마이크로리터의 세포 분리 용액을 추가합니다.섭씨 37도에서 5% 이산화탄소 아래에서 30분 동안 용액에 세포를 배양합니다. 10밀리리터 혈청학적 피펫을 사용하여 각 웰에 동일한 부피의 ENC 배지를 추가합니다. 용액을 기계적으로 피펫팅하여 남아 있는 스페로이드를 분해합니다.그런 다음 세포를 50밀리리터 원추형 튜브로 옮깁니다. 이전과 같이 원심분리 후 상층액을 폐기하십시오. 그런 다음, 5 내지 10 밀리리터의 ENC 배지에 세포를 재현탁시킨다.trypan blue와 혈구계를 사용하여 생존 가능한 세포의 농도를 계산합니다. 지금, 대략 300, 000에서 400, 표면의 평방 센티미터 당 000의 실행 가능한 세포, 및 밀리리터 당 대략 1백만개의 세포의 조밀도를 도금하기 위하여 ENC 매체의 충분한 양을 추가하십시오. 그런 다음 우물에서 용액을 흡인합니다.다음으로, PO/FN 라미닌 코팅 웰이 있는 플레이트에 셀을 추가합니다. 30일에서 40일까지 웰 표면적의 평방 센티미터당 200마이크로리터의 ENC 매체로 이틀에 한 번씩 셀을 공급합니다. 매끄러운 표면을 가진 고품질의 자유 부유 구체는 신경능선 유도 후 관찰되었습니다.스페로이드는 신경능선 마커 SOX10을 발현했습니다. 신경돌기는 장 뉴런 유도 동안 25일에서 30일 사이에 관찰되었습니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Differentiation of Enteric Neural Crest Spheroid and Neuronal Induction from Human Pluripotent Stem Cells for Enteric Nervous System Research

Differentiation of Enteric Nervous System Lineages from Human Pluripotent Stem Cells

The human enteric nervous system, ENS, is a large network of glial and neuronal cell types with remarkable neurotransmitter diversity. The ENS controls ...

연구

신경과학

Formation of Neural Crests from Human Pluripotent Stem Cells for Enteric Nervous System Research

장 신경계 연구를 위한 인간 만능 줄기 세포의 신경 능선 형성