differentiation of enteric neural crest spheroid and neuronal induction from human pluripotent stem cells for enteric nervous system research

Derivation of Enteric Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

The enteric nervous system (ENS) is the largest component of the peripheral nervous system. The ENS contains more than 400 million neurons that are located within the GI tract and control nearly all functions of the gut1. Molecular understanding of the ENS development and function and its defects in enteric neuropathies requires access to a reliable and authentic source of enteric neurons. Access to human primary tissue is limited, and animal models fail to recapitulate key disease phenotypes in many enteric neuropathies. Human pluripotent stem cell (hPSC) technology has proven exceedingly beneficial in providing an unlimited source of desired cell types, especially those that are difficult to isolate from primary sources2,3,4,5,6,7. Here, we provide details of a stepwise and robust in vitro method to obtain ENS cultures from hPSCs. These scalable hPSC-derived cultures open avenues for developmental studies, disease modeling, and high-throughput drug screening and can provide transplantable cells for regenerative medicine.
Enteric neuron lineages are derived from neural crest (NC) cells following the ENS developmental path during embryogenesis. In embryos, NC cells emerge along the margins of the folding neural plate. They proliferate, migrate and give rise to many different cell types including sensory neurons, Schwann cells, melanocytes, craniofacial skeleton and enteric neurons and glia8,9,10. The cell fate decision depends on the distinct region along the anterior-posterior axis that the NC cells emerge from, i.e., cranial NC, vagal NC, trunk NC and sacral NC. The ENS develops from vagal and sacral NC cells with the former dominating the population of the enteric neurons owing to the extensive migration along the length of the bowel and colonizing the gut11.
Derivation of NC cells from PSCs commonly involves a combination of dual SMAD inhibition and WNT pathway activation12,13. Until recently, all NC induction protocols involved serum and other animal product additives in the culture conditions. Chemically undefined media not only lower the reproducibility of NC induction but also challenge mechanistic developmental studies. To overcome these challenges, Barber et al14 developed an NC induction protocol using chemically defined culture conditions and was hence advantageous over alternative methods that rely on serum-replacement factors (e.g., KSR)13,14. This was obtained by basal media replacements and optimizing a protocol originally presented by Fattahi et al to derive enteric NC cells from hPSCs. This improved system is the basis of the hPSC differentiation protocol that is presented here. It begins with induction of enteric neural crest (ENC) cells in a 15-day period by precise modulation of BMP, FGF, WNT and TGF&#946; signaling in addition to retinoic acid (RA). We then derive the ENS lineages by treating cells with glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF). All media compositions are chemically defined and yield robust enteric neuronal cultures within 30-40 days.
In addition to the monolayer cell culture system described here, alternative NC induction approaches have been developed which use free-floating embryoid-bodies15,16. Migratory cells in these cultures have been shown to express NC markers with a subset representing the vagal NC. Co-cultures with primary gut tissue have been used to enrich enteric NC precursors in these cultures. Media compositions in these studies contain a combination of different factors such as nerve growth factor, NT3 and brain-derived neurotrophic factor. At this stage, it is not fully clear how these factors might affect the enteric neuron precursor commitment identities. For an efficient comparison of the enteric NC induction in the monolayer and the embryoid-body-based cultures more data is required. Given the different culture layouts in these strategies, the use of each method should be considered and optimized according to specific application in mind.
The protocol presented here is reproducible and has been successfully tested by us and others using different hPSC (induced and embryonic) lines8,14,16.

Author Spotlight: Robust Culture of Human Enteric Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Enterik Sinir Sistemi Soylarının İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Farklılaşması

Enterik Sinir Sistemi Araştırmaları için İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Enterik Nöral Krest Küresel ve Nöronal İndüksiyonun Farklılaşması

Başlamak için, nöral krest indüksiyonuna tabi tutulmuş 12 günlük insan pluripotent kök hücre kültürlerini alın. Hücrelerden C ortamını nazikçe aspire edin. Hücreleri yıkamak için kuyu yüzey alanının santimetre karesi başına 100 mikrolitre PBS ekleyin ve ardından PBS'yi çıkarın.Hücrelere eşit hacimde hücre ayırma çözeltisi ekleyin ve 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit takviyesi altında 30 dakika inkübe edin. Plakaya eşit hacimde NCC ortamı ekleyin. Ardından, hücre süspansiyonunu hasat etmek için serolojik bir pipet kullanın ve 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.Hücreleri 290G'de 20 ila 25 santigrat derece arasında iki dakika döndürün. Hücre peletini bozmadan süpernatanı dikkatlice atın. Hücre peletine 12 mililitre NCC ortamı pipetlemek için 10 mililitrelik bir serolojik pipet kullanın.Bir süspansiyon oluşturmak için süspansiyonu mekanik olarak yukarı ve aşağı pipetleyin. Ardından, hücre süspansiyonunu ultra düşük bir bağlantı plakasına aktarın. 14. günde, her bir oyuğun merkezinde küçük sferoidleri toplamak için hücre kültürü plakalarını hafifçe döndürün.Harcanan ortamı her bir oyuğun çevresinden yavaşça aspire etmek için bir P1000 mikro pipet kullanın. Hücreleri orijinal NCC ortamı hacmiyle yeniden besleyin. 15. günde, ortamı dikkatlice çıkarın.Sferoidleri yıkamak için kuyulara PBS ekleyin. Ardından, sferoidlerin rahatsız edilmediğinden emin olarak mümkün olduğunca fazla PBS'yi çıkarın. Daha sonra, kuyu yüzey alanının santimetre karesi başına 100 mikrolitre hücre ayırma çözeltisi ekleyin.Çözeltideki hücreleri 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit altında 30 dakika inkübe edin. 10 mililitrelik bir serolojik pipet ile her oyuğa eşit hacimde ENC ortamı ekleyin. Kalan sferoidleri kırmak için çözeltiyi mekanik olarak pipetleyin.Daha sonra hücreleri 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Daha önce olduğu gibi santrifüjlemeden sonra süpernatanı atın. Daha sonra, hücreleri 5 ila 10 mililitre ENC ortamında yeniden süspanse edin.Tripan mavisi ve hemositometre kullanarak canlı hücrelerin konsantrasyonunu sayın. Şimdi, yüzey alanının santimetre karesi başına yaklaşık 300.000 ila 400.000 canlı hücre ve mililitre başına yaklaşık 1 milyon hücre yoğunluğu için yeterli miktarda ENC ortamı ekleyin. Ardından, çözeltileri kuyulardan aspire edin.Daha sonra, hücreleri PO / FN laminin kaplı oyuklara sahip bir plakaya ekleyin. Hücreleri her gün, 30 ila 40 güne kadar kuyu yüzey alanının santimetre karesi başına 200 mikrolitre ENC ortamı ile besleyin. Nöral kret indüksiyonundan sonra pürüzsüz yüzeylere sahip yüksek kaliteli serbest yüzen küreler gözlendi.Sferoidler, nöral krest işaretleyici SOX10'u ifade etti. Enterik nöron indüksiyonu sırasında 25 ila 30. günler arasında nöritler gözlendi.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Differentiation of Enteric Neural Crest Spheroid and Neuronal Induction from Human Pluripotent Stem Cells for Enteric Nervous System Research

Differentiation of Enteric Nervous System Lineages from Human Pluripotent Stem Cells

The human enteric nervous system, ENS, is a large network of glial and neuronal cell types with remarkable neurotransmitter diversity. The ENS controls ...

Nörobilim

Formation of Neural Crests from Human Pluripotent Stem Cells for Enteric Nervous System Research

Enterik Sinir Sistemi Araştırmaları için İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Nöral Krestlerin Oluşturulması