후성유전학적 프로파일링을 위한 태그가 지정된 마우스 근모세포 DNA의 게놈 정제 및 라이브러리 준비

먼저, 150 마이크로리터의 태깅 완충액을 태멘테이션된 마우스 근아세포 샘플이 들어 있는 샘플 튜브에 추가합니다. EDTA, SDS 및 proteinase K를 각 튜브에 피펫팅합니다. 튜브의 내용물을 소용돌이쳐 잘 섞은 다음 PCR 기계에서 섭씨 55도에서 2시간 동안 튜브를 배양합니다.

다음으로, 각 샘플을 200마이크로리터의 페놀-클로로포름 혼합물이 들어 있는 1.5밀리리터 원심분리기 튜브에 피펫팅합니다. 튜브의 내용물을 소용돌이치게 하여 혼합합니다. 원심분리가 완료되면 최상층을 새 1.5밀리리터 원심분리기 튜브로 옮깁니다.

그런 다음 200마이크로리터의 클로로포름을 새 튜브에 넣고 다시 소용돌이치고 원심분리합니다. 최상층을 새 튜브에 흡입합니다. 이제 각 샘플 튜브에 550 마이크로 리터의 100 % 에탄올을 넣고 뒤집어서 잘 섞습니다.

그런 다음 튜브를 섭씨 영하 80도에서 1시간 동안 두어 DNA 침전을 유도합니다. DNA 펠릿을 얻기 위해 15분 동안 최대 속도로 용액을 원심분리합니다. 상층액을 부은 후 펠릿을 75% 에탄올로 세척한 후 5분 동안 다시 원심분리합니다.

그런 다음 펠릿을 21 마이크로 리터의 이중 증류수에 재현탁시킵니다. 라이브러리 준비에 사용할 PCR을 설정합니다. 각 샘플에 대해 다른 N7XX Illumina 프라이머와 범용 N5XX 프라이머를 사용합니다.

PCR 주기 번호를 기기에 입력하여 PCR을 실행합니다. 증폭 후, 아가로스 겔에 라이브러리 3마이크로리터를 전기영동합니다. CUT&Tag 라이브러리에는 대부분 약 300개의 염기쌍으로 구성된 태그가 지정된 단핵체가 포함되어 있었습니다.

qPCR은 H3K4me1 마크가 MYOD1 유전자의 인핸서 영역에서 매우 풍부하다는 것을 보여주었습니다.