For at begynde skal du tilføje 500x orange farvestof til en PBS-løsning for at opnå forskellige farveforhold, start Data Acquisition-softwaren på skrivebordet. Klik på Instrument, vælg derefter den tilsvarende mikroplademodel, og vælg Okay. Klik på Anskaffelsesindstillinger, og vælg Fluorescens.
Under bølgelængdegrænsefladen skal du indstille lambdaen til 470 nanometer og 570 nanometer, og derefter trykke på Okay. Pipetter 100 mikroliter af hver koncentration af det orange farvestof i brøndene på en 96-brøndsplade. Placer pladen i detektionstrinnet af det fluorescerende mikropladelæserinstrument.
Klik på Læs-ikonet på softwaren, og mål fluorescensen af hver farvestofkoncentration 13 gange ved stuetemperatur med et interval på to minutter. Efter hver bestemmelse skal du klikke på ikonet Eksporter og derefter vælge Eksporter til XML XLS TXT. Vælg alle plader.
Vælg derefter Plade i outputformatet, og klik på Okay for at gemme dataene i XLS-formatet til yderligere analyse. Tænd nu for det digitale varmerystende tørbad. Indstil opvarmningstemperaturen til 35 grader Celsius og opvarmningstiden til to minutter.
Forbered det optimale fortyndingsforhold for farvestof i et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Læg den derefter i det digitale varmeristende tørre bad i to minutter. Tilsæt nu 100 mikroliter af både PBS og farvningsopløsningerne til pladens brønde.
Placer pladen i instrumentets detektionstrin. Klik på ikonet Læs i dataindsamlingssoftwaren. Indstil opvarmningstemperaturen til 40 grader Celsius og opvarmningstiden til to minutter.
Pipetterer nu farveopløsningen i pladen tilbage i 1.5 ml mikrocentrifugerøret. Varm det op i det digitale varmeristende tørre bad i to minutter. Gentag tilsætningen af farveopløsningerne, og eksporter de resulterende data for at teste absorbansen af farveopløsningen ved fem graders temperaturintervaller fra 35 til 95 grader Celsius.
Kombiner CD40-proteinopløsning med PBS for at opnå endelige koncentrationer på 5, 10, 15 og 20 mikrogram pr. mikroliter. Dernæst kombineres orange farvestof med PBS for at opnå en endelig koncentration på en er til 500. Vurder absorbansen af CD40-proteinopløsningen ved fem graders temperaturintervaller fra 35 til 95 grader Celsius.
Gem dataene som XLS-filer, og beregn derefter smeltepunktet eller TM-værdien ved hjælp af dataanalysesoftwaren. Bland derefter CD40 og Umbelliferone i PBS-opløsningen. Pipettere derefter det orange farvestof ind i PBS for at få en opløsningskoncentration på en er til 500.
Mål absorbansen af CD40 umbelliferonkompleksopløsningen ved fem graders temperaturintervaller fra 35 til 95 grader Celsius. Det orange farvestof udviste konsekvent stabil fluorescensexcitation ved både stuetemperatur og forhøjede temperaturer. Et optimalt fortyndingsforhold på en er til 500, blev bestemt.
En stabil TM-værdi på 51,82 grader Celsius kunne påvises ved en koncentration på 15 mikrogram pr. milliliter, som faldt til 45,79 grader Celsius med en stigning i CD40-proteinkoncentrationen.