Для начала подготовьте зажимные держатели и металлические хомуты. Поместите соответствующие держатели зажимов с одним металлическим зажимом в монтажную станцию. Поместите влажные кусочки автоклавной бумаги поверх металлических зажимов.
Разрежьте бумагу по внутренним границам зажимов скальпелем. Отрежьте еще два кусочка бумаги меньшего размера и держите их влажными. С помощью заостренного пинцета поместите восемь стержневых эксплантов на бумагу между металлическими зажимами так, чтобы их конечные точки были на зажимах.
Накройте конечные точки стержневых эксплантов более мелкими кусочками бумаги и сверху наденьте металлические зажимы. Используйте отвертку и небольшие винты, чтобы зафиксировать стержневые экспланты между металлическими зажимами и держателем зажима. Осторожно переложите зажатые стержневые экспланты в силиконовые культуральные камеры и заполните эти камеры двумя миллилитрами стандартной клеточной питательной среды.
Затем зафиксируйте сборку дополнительными винтами. Чтобы приготовить гидрогель коллагена, сначала удалите клетки-мишени из чашек для культуры тканей с помощью раствора для отслоения клеток. Затем центрифугу при 400G в течение пяти минут при комнатной температуре, затем ресуспендировать в одном миллилитре стандартной питательной среды.
Затем приготовьте сшивающий раствор, смешав 10 микролитров PBS, 1,28 микролитров одного молярного NaOH и 8,72 микролитров двойной дистиллированной воды на ассамблоид. Добавьте клеточную суспензию из 12 ассамблоидов и поместите пробирку на лед. Отрегулируйте клеточную суспензию таким образом, чтобы были достигнуты следующие конечные концентрации.
Отдельно приготовьте коллагеновый один раствор, добавив 80 микролитров коллагена по одному на ассамблоид и поместите тюбик на лед. После того, как растворы будут готовы на льду, аспирируйте питательную среду клеток из камер, содержащих зажатые стержневые экспланты. Добавьте один раствор коллагена в раствор для сшивания и быстро перемешайте, пипетируя без образования пузырьков.
Добавьте 200 микролитров смешанного раствора в канавки в силиконовых камерах, чтобы покрыть отдельные экспланты сухожильного сердечника. Дайте гидрогелям полимеризоваться в течение 50 минут при температуре 37 градусов по Цельсию. Затем осторожно заполните силиконовые культуральные камеры 1,5 миллилитрами соответствующей питательной среды, пипетируя ее в углы камер.
Поместите камеры в большую чашку Петри или стерильную коробку, прежде чем поместить их в инкубатор. Культивируют ассамблоиды в соответствующих условиях, меняя питательную среду два раза в неделю. Извлеките сборки из хомутов ножницами.
При необходимости используйте пинцет, чтобы отделить стержневые эксплантаты от внешнего отсека гидрогеля. При культивировании ассамблоида в условиях пораженной культуры в течение более 21 суток наблюдалось, что эксплант ядра оставался механически растяжимым, неизменным по внешнему виду, визуально различимым и физически отделимым от окружающего гидрогеля. Кроме того, окружающий гидрогель уплотнялся с течением времени, в зависимости от популяции засеянных клеток, при этом фибробласты, полученные из ахиллова сухожилия, сокращались быстрее всего окружающим их гидрогелем.
Оценка жизнеспособности, морфологии и распространения клеток в 3D-гидрогеле коллагена с помощью конфокальной микроскопии показала, что жизнеспособность сохранялась во время ассамблоидной культуры, по крайней мере, до седьмого дня. Кроме того, экспрессия генов Vegfa и Mmps сильно увеличилась в эксплантах ядра, что видно при транскриптомном анализе. Аналогичным образом, анализ секретома выявил присутствие цитокинов, таких как фактор роста эндотелия сосудов, в стержневых эксплантах.
