Para empezar, coloque todos los materiales necesarios para el cultivo de células HEK 293 en la campana de bioseguridad limpia. Después de la descongelación, transfiera la suspensión celular HEK 293 del vial a un medio celular de suspensión precalentado de 30 mililitros en un tubo de 50 mililitros. Incubar las celdas a 37 grados centígrados con 80% de humedad, 8% de dióxido de carbono y 200 RPM durante tres o cuatro días.
Agregue 100 microlitros de suspensión celular a los 400 microlitros de la solución azul de tripano al 0,4% e invierta suavemente el tubo para mezclar. Coloque 50 microlitros de la suspensión celular tratada con azul de tripano en el portaobjetos del hemocitómetro, cuente el total de células viables y calcule la cantidad requerida de suspensión celular para la transfección. Agregue la cantidad requerida de suspensión celular a un medio celular de suspensión precalentado e incube a 37 grados Celsius con 8% de dióxido de carbono.
Agregue 1 millón de células por mililitro de suspensión celular HEK 293 en 300 mililitros de medio celular de suspensión e incube a 37 grados Celsius con 8% de dióxido de carbono. En el segundo día, caliente el medio celular de suspensión, los plásmidos y el reactivo de transfección a temperatura ambiente. Agregue plásmidos al medio preparado y al vórtice brevemente, luego agregue el reactivo de transfección y el vórtice nuevamente brevemente, antes de incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.
Durante la incubación de la mezcla de transfección, cuente las células cultivadas el primer día y, si es necesario, ajuste la densidad celular entre dos y 2,5 millones de células por mililitro. Después de 30 minutos, gota a gota, agregue la mezcla de transfección a las células mientras agita suavemente el tubo e incube durante 72 a 96 horas. En el quinto día, agregue 33 mililitros de tampón de lisis celular 10x a las células y mezcle agitando suavemente.
Incubar la suspensión a 37 grados centígrados durante 1,5 horas agitando. Centrifugar la suspensión celular a 3.428 G a cuatro grados centígrados durante 60 minutos. Filtre el sobrenadante a través de un filtro de vacío PES de 0,45 micras y recoja el lisado clarificado en el recipiente del filtro.
Añadir 90 mililitros de solución PEG 8.000 al 40% a 360 mililitros de lisado celular filtrado. Agregue una barra de agitación esterilizada con etanol al 70% al lisado celular y revuelva a 300 RPM en hielo o en una cámara fría durante una hora, luego incube durante la noche a cuatro grados centígrados sin agitar.