Neem om te beginnen een 70 tot 90%confluente cultuur van menselijke baarmoederfibroblasten. Zuig het medium uit de kolven op. Was de cellen met vijf milliliter warm calcium en magnesiumvrij DPBS.
Nadat het DPBS is opgezogen, pipetteert u vier milliliter warme trypsine EDTA in elke kolf. Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius gedurende drie tot vijf minuten totdat de cellen loskomen. Voeg vervolgens zes milliliter druppels en neutraliserende oplossing toe aan elke kolf.
Breng vervolgens de celsuspensie over in een conische buis van 15 milliliter. Gebruik een pipet om de suspensie goed te mengen en neem een aliquot van 10 microliter voor het tellen van cellen. Meng 10 microliter van de celsuspensie met 10 microliter Trypan Blue.
Breng de gekleurde celsuspensie over naar een hemocytometer voor het tellen van cellen. Centrifugeer vervolgens de celsuspensie bij 300 G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Na het opzuigen van het supernatant, resuspendeert u de pellet in warm fibroblastmedium.
Was nu het basale kanaal van een microfluïdische orgaanchip met 200 microliter fibroblastmedium. Was vervolgens het apicale kanaal met 200 microliter verwarmd vaginaal epitheelmedium. Voeg 200 microliter volledig vaginaal epitheelmedium toe aan de inlaat van het apicale kanaal, terwijl u de uitlaat afsluit met een pipetpunt.
Doseer het medium totdat de volumes van de inlaat- en uitlaattip gelijk zijn. Laat vervolgens de pipetpunt los van de pipet en laat de punt in de inlaat. Pipetteer langzaam 50 microliter van de menselijke uterine fibroblastcelsuspensie in de inlaat van het basale kanaal, terwijl u tegelijkertijd uit de uitlaat zuigt.
Verwijder de pipetpunt uit de inlaat wanneer er ongeveer twee microliter van de celsuspensie in de pipetpunt achterblijft. Draai de plugchips ondersteboven op een buizenrek van 15 milliliter. Controleer de chips na incubatie op celaanhechting.
Sluit vervolgens het stopcontact van het basale kanaal aan met een pipetpunt. Voeg vervolgens 200 microliter fibroblastmedium toe aan de inlaat van het basale kanaal zonder de pipetzuiger naar beneden te duwen. Laat de punt van de pipet los om het medium vrij door het kanaal naar de punt van de uitlaatpipet te laten stromen door middel van zwaartekracht.
Incubeer de fibroblast gezaaide chips een nacht bij 37 graden Celsius met 5% kooldioxide-suppletie.
