Для начала промаркируйте две миллилитровые пробирки для микроцентрифуг. Пипетка 50 микролитров аликвот культуры E.coli DnaK756 в пробирки. Положите трубочки на лед.
Добавьте от 10 до 50 нанограммов плазмидной ДНК в каждую отдельную пробирку с аликвотами E.coli. Держите трубочки на льду 30 минут. Затем поместите ячейки при температуре 42 градуса Цельсия на 60 секунд, чтобы вызвать тепловой шок.
Верните трубочки в лед на 10 минут. Пипеткой насыпьте в пробирки 950 микролитров свежего двухкратного дрожжевого триптонового бульона, затем инкубируйте пробирки в шейкере при температуре 37 градусов по Цельсию. Пипеткой 100 мкл трансформированной клеточной культуры и распределите их по агаровым пластинам с двукратным содержанием дрожжевого триптона, содержащего антибиотики.
Центрифугируйте остальные клетки в течение одной минуты при температуре 5 000 G при температуре четыре градуса Цельсия. Сцедите около 800 микролитров бульона. Ресуспендируйте гранулированные ячейки в оставшейся среде.
Выложите восстановленные клетки на тарелку с двукратным дрожжевым триптоновым агаром, затем инкубируйте обе пластины с агаром при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи. Чтобы покрыть клетки, используйте стерильную петлю, чтобы забрать одну колонию из трансформентов. Сделайте ему прививку в 10 миллилитров двукратного дрожжевого триптонового отвара, дополненного антибиотиками.
Теперь приготовьте последовательные разведения клеток от 100 до 10 до минус пятой в двухмиллилитровых микроцентрифужных пробирках. Перед обнаружением клеток поместите агаровые пластины, дополненные антибиотиками и IPTG, в духовку при температуре 40 градусов Цельсия с частично открытыми крышками. Как только планшеты достаточно высохнут, поместите два микролитра последовательно разбавленных клеток на агаровые пластины.
Выложите каждый образец на две отдельные тарелки. Инкубируйте одну чашку при допустимой температуре роста 37 градусов Цельсия, а другую при недопускающей температуре роста 43,5 градусов Цельсия. Для подтверждения экспрессии рекомбинантных белков с помощью стерильной петли подбирают часть оставшихся клеток из той же колонии трансформентов.
Инокуляция клеток в 10 миллилитров дрожжевого отвара триптона, дополненного антибиотиком. Инкубируйте культуры в шейкере в течение ночи при температуре 37 градусов по Цельсию. Все клетки E.coli DnaK756 росли при допустимой температуре роста 37 градусов по Цельсию.
Однако только гетерологичные клетки, экспрессирующие DnaK и KPf, росли при непермиссивной температуре роста. Мутантные клетки, экспрессирующие KPf-V436F, росли только при 37 градусах Цельсия, но не могли расти при 43,5 градусах Цельсия.