Para empezar, pipetea 80 microlitros de células de E. coli transformadas en un vial. Pipetear 20 microlitros de tampón de carga cuatro veces Laemmli SDS en el vial. Hervir la suspensión a 100 grados centígrados durante 10 minutos en un bloque calefactor.
A continuación, cargue 10 microlitros de la muestra en un gel SDS prefabricado. Electroforesar el gel a temperatura ambiente durante una hora a 120 voltios en el tampón de funcionamiento SDS. Una vez completada la electroforesis, tiñe el gel en la tinción de Coomassie durante una hora.
Decolorar el gel en un tampón decolorante que contenga un 50 % de metanol y un 10 % de ácido acético en agua destilada durante dos horas. Coloque el gel en un sistema de imágenes de gel para visualizar las bandas de proteínas. A continuación, transfiera las proteínas del gel SDS a una membrana de nitrocelulosa.
Lave la membrana de nitrocelulosa tres veces en tampón de lavado. Transfiera la membrana a leche descremada al 5% que contenga anticuerpos diluidos en una proporción de uno a 2.000. Incubar la membrana con los anticuerpos a cuatro grados centígrados mientras se agita a 60 RPM durante una hora.
A continuación, lave la membrana de nitrocelulosa en tampón TBS tres veces durante 15 minutos cada una para eliminar cualquier anticuerpo no unido específicamente. Ahora transfiera la membrana a una placa con el anticuerpo secundario. Incubar la membrana a cuatro grados centígrados mientras se agita a 60 RPM durante una hora.
Después de lavar la membrana como antes, use un reactivo de detección de quimioluminiscencia mejorado para resolver las bandas. Visualice las bandas con un generador de imágenes de gel.
