Para começar, centrifugue fibroblastos dérmicos humanos normais tripsinizados. Remova o sobrenadante do tubo centrifugado. Adicione o meio de baixa glicose DMEM suplementado pré-aquecido ao pellet e misture bem para ressuspendê-lo.
Coloque os fibroblastos dérmicos humanos normais em uma placa de cultura de células aderentes de 10 centímetros. Balance suavemente o prato de maneira transversal. Após 14 dias de estimulação 2D, quando as células se tornarem confluentes, aspire o meio e use um raspador de células para separar suave e rapidamente a folha de células formada do prato.
Simultaneamente, enrole a folha de célula em um organoide 3D semelhante a uma haste. Transfira os organoides de fibroblastos dérmicos humanos normais para uma placa de Petri não aderente de 10 centímetros de largura. Meça o alongamento com uma régua.
Em seguida, segure um lado do organoide com uma pinça e estique suavemente o organoide até que ele seja alongado axialmente em aproximadamente 10%Usando uma pinça, pressione manualmente os pinos de metal através de ambas as bordas do organoide no prato de plástico para fixá-lo. Finalmente, para maturação 3D, adicione 10 mililitros de meio de alta glicose DMEM suplementado pré-aquecido antes da incubação. A morfologia macroscópica dos organoides 3D nos dias zero e 14 da etapa de maturação 3D mostrou uma aparência branca brilhante.
Com o tempo, os organoides se contraíram e pareceram mais densos. A morfologia dos organoides foi avaliada por meio da coloração HE. No primeiro dia, os organoides apresentaram camadas desconectadas, compostas principalmente por células circundadas por baixas quantidades de matriz.
As células dentro das camadas exibiam núcleos com formato redondo e tamanhos variados. No 14º dia, foi observado um aumento notável no sinal de eosina, o que indicou deposição de matriz e camadas fundidas. Além disso, os organoides apresentaram a presença de áreas contendo células alinhadas.
A maioria dos núcleos tinha tamanhos semelhantes e, ocasionalmente, eram alongados.
