Nehmen Sie zunächst die Tube mit frisch geernteten GUVs. Fügen Sie Streptavidin-Lösung hinzu und lassen Sie sie 30 Minuten bei Raumtemperatur ruhen. Geben Sie dann einen Mikromolaren b-disiLID in die GUV-Lösung.
Decken Sie die Probe mit Alufolie ab und bewahren Sie sie im Dunkeln auf. Eine 18-Well-Glasbodenkammer des Mikroobjektträgers 10 Minuten lang mit 150 Mikrolitern BSA-Lösung vorbehandeln. Entfernen Sie dann die BSA-Lösung und waschen Sie die Vertiefungen dreimal mit 150 Mikrolitern Wasser.
Geben Sie als Nächstes 145 Mikroliter 200 nanomolare mOrange-Nano in Puffer in die Vertiefung. Geben Sie fünf Mikroliter GUVs, die mit einem b-disiLID verziert sind, in die Lösung. Decken Sie die Probe mit Aluminiumfolie ab und warten Sie etwa 15 Minuten, bis sich die Vesikel abgesetzt haben.
Legen Sie anschließend den Objektträger unter das konfokale Mikroskop. Stimulieren Sie die Probe bei 552 Nanometern für die mOrange-Visualisierung. Und bei 638 Nanometern für DID in den Membranen des GUV.
Die mOrange-Nano-GUVs zeigten im Dunkeln keine Fluoreszenz. Die an der GUV-Membran quantifizierte mOrange-Intensität zeigte eine schnelle und effektive Proteinrekrutierung bei voller Reversibilität.