flow cytometric data acquisition of microbial aggregates

Quantitative Analyse der mikrobiellen Autoaggregation mittels bildgebender Durchflusszytometrie

Bacterial autoaggregation is considered a primary step in biofilm formation. In this process (sometimes also called autoagglutination or flocculation), bacteria of the same type form multicellular clumps that eventually settle at the bottom of culture tubes or attach to their target tissue or surface1.
Autoaggregation is a widely observed phenomenon and has been shown so far in Gram-negative pathogens such as the opportunistic pathogen Acinetobacter baumannii2, the dental pathogen Aggregobacter actinomycetemcomitans3, and the emerging pathogen Burkholderia pseudomallei4. Autoaggregation has also been described in several probiotic Gram-positive strains5,6,7,8. In Lactobacillus (L.) acidophilus, autoaggregation was partially mediated by S-layer proteins and correlated with an adhesion to xylan7. Similarly, we found a correlation between glucose-dependent autoaggregation and induction of the adhesive properties (as judged by adhesion to mucin) of the probiotic species Lacticaseibacillus rhamnosus GG, Lacticaseibacillus casei, L. acidophilus, Lacticaseibacillus paracasei, and Lactiplantibacillus plantarum5. The increased autoaggregation most likely reflected changes in the expression of cellular adhesins in response to glucose and its catabolites9. While the molecular mechanisms of autoaggregation remain to be determined, it has been shown that this process alters the phenotype of the aggregated bacteria and grants them enhanced tolerance to environmental stressors1, as well as increased sensitivity to quorum sensing molecules10.
Several approaches have been used to measure autoaggregation; one experimental approach is to let cultures stand statically in narrow culture tubes for a given time. Control cultures remain turbid, whereas autoaggregation cultures will settle at the bottom of the tube. A more quantitative approach measures autoaggregation by sedimentation or settling assay11.
Flow cytometry has also been increasingly employed in recent years to investigate bacterial autoaggregation. This method is appropriate for analyzing particles between approximately 0.5 and 1000 &#181;m in size. The single bacterium or formed aggregates are suspended in fluid, fed into a stream, and can be detected one by one11. Recording forward scattered light allows measuring the relative size of the cell or aggregate. It is relatively fast and straightforward but cannot detect several parameters, such as aggregate size or the average number of cells in aggregates. Therefore, this approach can be complemented microscopically, allowing more parameters to be checked12. However, traditional microscopy is time-consuming and thereby limits the number of tested samples and the statistical power of the analysis. In general, imaging flow cytometry provides several features compared to traditional flow cytometry, such as simultaneous analysis of cell morphology and phenotype, conducting image-based analysis, detecting rare events, and validating flow cytometry data13. These advantages enhance the capabilities of flow cytometry and facilitate a more detailed examination of cell populations.
This study provides a valuable protocol for imaging flow cytometry to monitor autoaggregation in lactic acid bacteria (LAB). These Gram-positive rods are facultative anaerobes and belong to the LAB group. These efficient glucose fermenters generate lactic acid as their main end-product of carbohydrate metabolism14. These bacteria are beneficial core members of the microbiome and are naturally found in the gastrointestinal tract (GIT) of humans and animals, as well as in the urogenital tract of females15. Therefore, the exact characterization of their autoaggregation properties is of high biotechnological and clinical interest.
Our previous findings indicated that the basal level of autoaggregation differs between different probiotic strains. This heterogeneity is affected by the different carbohydrates used as a carbon source5. To overcome this fundamental property of probiotic bacteria, the effects of carbohydrates from the diet were monitored on autoaggregation on the single-cell level using IFC. This IFC-based approach combines the power and speed of traditional flow cytometers with the microscope&#39;s resolution. Therefore, it allows high-rate complex morphometric measurements in a phenotypically defined way16,17. This approach can be extended to other probiotic and pathogenic bacteria, combined with fluorescent reporters to monitor gene expression, and fluorescently labeled strains to monitor the presence and abundance of specific bacterial species in heterogeneous aggregates.

Autor im Rampenlicht: Förderung der Forschung in der mikrobiellen Autoaggregation mit bildgebender Durchflusszytometrie

Bildgebende Durchflusszytometrie zur Untersuchung der mikrobiellen Autoaggregation

This study utilized Lactobacillus species as a model to demonstrate the effectiveness of imaging flow cytometry analysis in studying microbial autoaggregation. The focus is on analyzing the response of autoaggregation of Lactobacillus species to simple carbohydrates from the diet. The most used methods for measuring autoaggregation are spectral photometry, which measures microbial suspensions, turbidity, or optical density, and traditional microscopy techniques, such as bright field, phase contrast, and fluorescent microscopy.When talking about hight-throughput imaging, one major experimental challenge is single event segmentation. In this protocol, it is a single aggregate. Imaging flow cytometry addresses this challenge elegantly and give researchers a powerful tool for studying autoaggregation.

Durchflusszytometrische Datenerfassung von mikrobiellen Aggregaten

Um mit der durchflusszytometrischen Analyse zu beginnen, stellen Sie zunächst den 785-Nanometer-Laser auf eine Leistung von fünf Milliwatt für Dunkelfeldmessungen ein. Verwenden Sie ein 60-faches Objektiv mit einer numerischen Apertur von 0,9. Wählen Sie dann die Einstellung "Hohe Empfindlichkeit" und stellen Sie die Geschwindigkeit auf "Niedrig" ein.Um die Stabilität der Kalibrierungsperle sicherzustellen, drücken Sie die Wiedergabetaste im Fluidikfeld und untersuchen Sie die Raupenbilder, die scharf und klar erscheinen sollten. Generieren Sie ein neues Streudiagramm im Arbeitsbereich, indem Sie Neues Streudiagramm auswählen. Wählen Sie dann den Bereich im Hellfeldkanal aus, der der Intensität des SSC-Kanals entspricht, und schließen Sie die Kalibrierungsperlen aus, die gleichzeitig in der Probe ausgeführt werden.Drücken Sie anschließend die Ladetaste und positionieren Sie ein Röhrchen mit der Laktobazillenprobe in den Halter. Geben Sie im Feld "Erfassungseinstellungen" den Namen des Beispiels ein und geben Sie den Speicherort für die Datenspeicherung an. Legen Sie die Anzahl der zu erfassenden Ereignisse fest, in der Regel im Bereich von 10.000 bis 20.000 Ereignissen.Beginnen Sie nun den Akquisitionsprozess, indem Sie auf die Schaltfläche Aufzeichnen klicken, die sich im Feld Akquisition befindet. Der Prozess wird nach Erreichen der angegebenen Anzahl von Ereignissen angehalten. Drücken Sie die Return-Taste, um das Rohr zu entladen und aus der Halterung zu entfernen, wie im Popup-Fenster angezeigt.Nachdem Sie den Vorgang für alle Stichproben wiederholt haben, speichern Sie die Vorlage, um die Einheitlichkeit der Datenerfassung zu gewährleisten. Um die Rohdatei für die Datenanalyse in die Analysesoftware zu laden, klicken Sie auf Datei und öffnen Sie die rif-Datei. Wählen Sie im geöffneten Fenster Akquisitionsanalyse verwenden aus, und klicken Sie dann auf OK. Um als Nächstes ein Histogramm des Gradienten-Mittelwerts zu erstellen, klicken Sie auf die Schaltfläche Neues Histogramm und wählen Sie die zu analysierende Grundgesamtheit aus der Erfassung aus.Wählen Sie unter der Funktion "X-Achse" die Option "Gradient RMS" des Hellfeldkanals aus. Platzieren Sie als Nächstes ein Gate, um nicht fokussierte Events auszuschließen, indem Sie im Analysebereich auf die Schaltfläche Linienbereich erstellen klicken. Erstellen Sie ein Streudiagramm der Fläche im Vergleich zum Seitenverhältnis, indem Sie im Analysebereich auf die Schaltfläche Neues Streudiagramm klicken.Wählen Sie die fokussierte Grundgesamtheit im Fenster Neues Streudiagramm aus. Wählen Sie dann den Bereich des Hellfeldkanals für die X-Achsen-Funktion aus. Wählen Sie das Seitenverhältnis für das Y-Achsen-Feature aus.Zeichnen Sie mit der Schaltfläche Rechteck erstellen ein Tor im Streudiagramm basierend auf dem Flächenwert für die Aggregat-Ereignispopulation. Zeichnen Sie auf ähnliche Weise ein weiteres Tor für die Einzel- und Kleinaggregatpopulation. Speichern Sie Ihre Datenanalyse als Vorlage, indem Sie auf die Registerkarte Datei klicken, Save As Template ast (Als Vorlage speichern) auswählen und dann die nächste Beispieldatei unter derselben Vorlage öffnen, um die Datenanalysedatei zu erstellen.Um die Verteilung der Aggregatgröße zu messen, erstellen Sie zunächst ein Histogramm des Bereichs der Grundgesamtheit der Aggregationsereignisse. Speichern Sie die Datenanalyse, indem Sie auf die Datei klicken und die Option Als Vorlage speichern auswählen. Öffnen Sie nach dem Speichern die nächste Beispieldatei unter derselben Vorlage für die Datenanalysedatei.Einzelne Zellen, kleine Aggregate, große Aggregate und Ketten wurden bei LGG und L. paracasei beobachtet, aber es war nicht möglich, zwischen Ketten und größeren Aggregaten zu unterscheiden. Signifikante Unterschiede in den Aggregationseigenschaften verschiedener LAB-Stämme wurden als Reaktion auf fermentierbare oder nicht fermentierbare Zucker beobachtet.

Research

JoVE Journal

Biology

Flow Cytometric Data Acquisition of Microbial Aggregates

Imaging Flow Cytometry to Study Microbial Autoaggregation

Beneficial and probiotic bacteria play essential roles in their hosts, providing various health benefits, including immunity to infectious diseases. The ...

Forschung

Biologie

Lactobacillaceae Sample Preparation for Flow Cytometric Analysis

Lactobacillaceae Probenvorbereitung für die durchflusszytometrische Analyse