flow cytometric data acquisition of microbial aggregates

Kvantitativ analys av mikrobiell autoaggregation med hjälp av avbildande flödescytometri

Bacterial autoaggregation is considered a primary step in biofilm formation. In this process (sometimes also called autoagglutination or flocculation), bacteria of the same type form multicellular clumps that eventually settle at the bottom of culture tubes or attach to their target tissue or surface1.
Autoaggregation is a widely observed phenomenon and has been shown so far in Gram-negative pathogens such as the opportunistic pathogen Acinetobacter baumannii2, the dental pathogen Aggregobacter actinomycetemcomitans3, and the emerging pathogen Burkholderia pseudomallei4. Autoaggregation has also been described in several probiotic Gram-positive strains5,6,7,8. In Lactobacillus (L.) acidophilus, autoaggregation was partially mediated by S-layer proteins and correlated with an adhesion to xylan7. Similarly, we found a correlation between glucose-dependent autoaggregation and induction of the adhesive properties (as judged by adhesion to mucin) of the probiotic species Lacticaseibacillus rhamnosus GG, Lacticaseibacillus casei, L. acidophilus, Lacticaseibacillus paracasei, and Lactiplantibacillus plantarum5. The increased autoaggregation most likely reflected changes in the expression of cellular adhesins in response to glucose and its catabolites9. While the molecular mechanisms of autoaggregation remain to be determined, it has been shown that this process alters the phenotype of the aggregated bacteria and grants them enhanced tolerance to environmental stressors1, as well as increased sensitivity to quorum sensing molecules10.
Several approaches have been used to measure autoaggregation; one experimental approach is to let cultures stand statically in narrow culture tubes for a given time. Control cultures remain turbid, whereas autoaggregation cultures will settle at the bottom of the tube. A more quantitative approach measures autoaggregation by sedimentation or settling assay11.
Flow cytometry has also been increasingly employed in recent years to investigate bacterial autoaggregation. This method is appropriate for analyzing particles between approximately 0.5 and 1000 &#181;m in size. The single bacterium or formed aggregates are suspended in fluid, fed into a stream, and can be detected one by one11. Recording forward scattered light allows measuring the relative size of the cell or aggregate. It is relatively fast and straightforward but cannot detect several parameters, such as aggregate size or the average number of cells in aggregates. Therefore, this approach can be complemented microscopically, allowing more parameters to be checked12. However, traditional microscopy is time-consuming and thereby limits the number of tested samples and the statistical power of the analysis. In general, imaging flow cytometry provides several features compared to traditional flow cytometry, such as simultaneous analysis of cell morphology and phenotype, conducting image-based analysis, detecting rare events, and validating flow cytometry data13. These advantages enhance the capabilities of flow cytometry and facilitate a more detailed examination of cell populations.
This study provides a valuable protocol for imaging flow cytometry to monitor autoaggregation in lactic acid bacteria (LAB). These Gram-positive rods are facultative anaerobes and belong to the LAB group. These efficient glucose fermenters generate lactic acid as their main end-product of carbohydrate metabolism14. These bacteria are beneficial core members of the microbiome and are naturally found in the gastrointestinal tract (GIT) of humans and animals, as well as in the urogenital tract of females15. Therefore, the exact characterization of their autoaggregation properties is of high biotechnological and clinical interest.
Our previous findings indicated that the basal level of autoaggregation differs between different probiotic strains. This heterogeneity is affected by the different carbohydrates used as a carbon source5. To overcome this fundamental property of probiotic bacteria, the effects of carbohydrates from the diet were monitored on autoaggregation on the single-cell level using IFC. This IFC-based approach combines the power and speed of traditional flow cytometers with the microscope&#39;s resolution. Therefore, it allows high-rate complex morphometric measurements in a phenotypically defined way16,17. This approach can be extended to other probiotic and pathogenic bacteria, combined with fluorescent reporters to monitor gene expression, and fluorescently labeled strains to monitor the presence and abundance of specific bacterial species in heterogeneous aggregates.

Författare i fokus: Främja forskning inom mikrobiell autoaggregering med hjälp av avbildande flödescytometri

Bildflödescytometri för att studera mikrobiell autoaggregation

This study utilized Lactobacillus species as a model to demonstrate the effectiveness of imaging flow cytometry analysis in studying microbial autoaggregation. The focus is on analyzing the response of autoaggregation of Lactobacillus species to simple carbohydrates from the diet. The most used methods for measuring autoaggregation are spectral photometry, which measures microbial suspensions, turbidity, or optical density, and traditional microscopy techniques, such as bright field, phase contrast, and fluorescent microscopy.When talking about hight-throughput imaging, one major experimental challenge is single event segmentation. In this protocol, it is a single aggregate. Imaging flow cytometry addresses this challenge elegantly and give researchers a powerful tool for studying autoaggregation.

Insamling av flödescytometriska data för mikrobiella aggregat

För att påbörja den flödescytometriska analysen, ställ först in 785-nanometerlasern på en effekt av fem milliwatt för mörkfältsmätningar. Använd ett 60X-objektiv med en numerisk bländare på 0,9. Välj sedan inställningen för hög känslighet och ställ in hastigheten på låg.För att säkerställa kalibreringssträngens stabilitet, tryck på Play-knappen i fluidikboxen och undersök pärlbilderna, som ska se skarpa och tydliga ut. Generera ett nytt spridningsdiagram i arbetsytan genom att välja Nytt spridningsdiagram. Välj sedan det område i Brightfield-kanalen som motsvarar SSC-kanalens intensitet och uteslut kalibreringspärlorna som körs samtidigt inom sample.Tryck sedan på Load-knappen och placera ett rör som innehåller laktobacillerna sample i hållaren. I rutan Förvärvsinställningar anger du provnamnet och anger platsen för datalagringen. Ange antalet händelser som ska samlas in, vanligtvis inom intervallet 10 000 till 20 000 händelser.Börja nu förvärvsprocessen genom att klicka på Spela in knappen som finns i Förvärv låda. Processen stoppas när den angivna mängden händelser har uppnåtts. Tryck på returknappen för att lossa röret och ta bort det från hållaren enligt uppmaningen i popup-fönstret.När du har upprepat processen för alla exempel sparar du mallen för att upprätthålla enhetligheten för datainsamling. För dataanalys, för att ladda råfilen i analysprogramvaran, klicka på Arkiv och öppna rif-filen. I det öppnade fönstret väljer du Använd förvärvsanalys och klickar sedan på OK. Därefter, för att skapa ett histogram av gradientrotens medelkvadrat, klicka på knappen Nytt histogram och välj populationen från förvärvet som ska analyseras.Under funktionen X-axel väljer du Gradient RMS för Brightfield-kanalen. Placera sedan en grind för att utesluta icke-fokuserade händelser genom att klicka på knappen Skapa linjeområde i analysområdet. Skapa ett spridningsdiagram över arean jämfört med proportionerna genom att klicka på knappen Nytt spridningsdiagram i analysområdet.Markera den fokuserade populationen i fönstret Nytt spridningsdiagram. Välj sedan området för Brightfield-kanalen för X-Ax-funktionen. Välj bildförhållande för funktionen Y-axel.Rita en grind på spridningsdiagrammet med knappen Skapa rektangel baserat på ytvärdet för den aggregerade händelsepopulationen. På samma sätt kan du rita en annan grind för singlar och små aggregat. Spara din dataanalys som en mall genom att klicka på fliken Arkiv, välja Spara som mall ast och öppna sedan nästa exempelfil under samma mall för att skapa dataanalysfilen.Om du vill mäta den aggregerade storleksfördelningen börjar du med att rita ett histogram över området för populationen av aggregeringshändelser. Spara dataanalysen genom att klicka på filen och välja alternativet Spara som mall. När du har sparat öppnar du nästa exempelfil under samma mall för dataanalysfilen.Enstaka celler, små aggregat, stora aggregat och kedjor observerades i LGG och L. paracasei men det var inte möjligt att skilja mellan kedjor och större aggregat. Signifikanta variationer i aggregeringsegenskaperna hos olika LAB-stammar observerades som svar på fermenterbara eller icke-fermenterbara sockerarter.

Research

JoVE Journal

Biology

Flow Cytometric Data Acquisition of Microbial Aggregates

Imaging Flow Cytometry to Study Microbial Autoaggregation

Beneficial and probiotic bacteria play essential roles in their hosts, providing various health benefits, including immunity to infectious diseases. The ...

Lactobacillaceae Sample Preparation for Flow Cytometric Analysis

Lactobacillaceae (Lactobacillaceae) Provberedning för flödescytometrisk analys