Beginnen Sie mit dem Mischen von Kasein, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon und BSA mit einem pH-Wert von sieben, um den Assay-Puffer herzustellen. Bereiten Sie als Nächstes 10 % Kaninchen-Immunglobulin G in Assay-Puffer vor, um den Probenverdünnungspuffer herzustellen. Bereiten Sie das Volumen der Arbeitsraupenmischung vor, das für die Prüfung erforderlich ist.
Anschließend das vorbereitete SARS-CoV-2 auftauen und die Überstände eine Stunde lang bei vier Grad Celsius kontrollieren. Markieren und ordnen Sie jeweils acht 1,5-Milliliter-Mikrofugenröhrchen für SARS-CoV-2 und Kontrollüberstände an. Um die höchste Verdünnung jedes Überstands zu erzielen, werden 600 Mikroliter des Überstands mit dem Probenverdünnungspuffer in entsprechend gekennzeichneten Röhrchen kombiniert, gefolgt von einem kurzen Vortexen des Röhrchens, um es zu mischen.
Übertragen Sie nacheinander 400 Mikroliter des einen Überstands auf einen verdünnten Überstand in das nächste Verdünnungsrohr. Jeden verdünnten Überstand kurz vortexen, bevor mit der nächsten Verdünnung fortgefahren wird. Nehmen Sie dann die vorbereitete Arbeitsperlenmischung nach 30 Sekunden Vortexen und geben Sie fünf Mikroliter in jede zugewiesene Vertiefung einer 384-Well-Mikrotiterplatte mit flachem Boden.
Geben Sie 45 Mikroliter der vorbereiteten Überstandsverdünnung in die zugewiesenen Vertiefungen, die Mikrosphären in der 384-Well-Platte enthalten. Verschließen Sie die Platte und inkubieren Sie sie über Nacht auf einem Orbitalschüttler bei 650 U/min im Dunkeln bei Raumtemperatur. Nachdem Sie die Mikrotiterplatte aus dem Orbitalschüttler genommen haben, zentrifugieren Sie die Platte eine Minute lang bei 931 g.
Entfernen Sie dann die Plattenversiegelung. Um die Kügelchen zu immobilisieren, legen Sie die Mikrotiterplatte für 30 Sekunden auf einen magnetischen Plattenseparator. Während die Mikrotiterplatte noch auf dem Magnetseparator positioniert ist, aspirieren Sie den Überstand aus magnetimmobilisierten Kügelchen.
Nachdem Sie die Mikrotiterplatte aus dem Magnetabscheider entfernt haben, geben Sie 60 Mikroliter PBST in jede Vertiefung, die die Kügelchen enthält. Nehmen Sie als Nächstes fünf 1,5-Milliliter-Röhrchen, um verschiedene Nachweismischungen zuzubereiten. Geben Sie humane monoklonale Anti-S1-Antikörper und FLAG-markierte, einkettige variable Fragmente, die auf das Spike-Protein auf dem SARS-CoV-2-Partikel abzielen, in jedes Röhrchen.
Geben Sie 50 Mikroliter pro Vertiefung der entsprechenden einkettigen, variablen fragmentspezifischen Spike-Detektionsmischung zu den gewaschenen Mikrosphären. Verschließen Sie die Mikrotiterplatte und inkubieren Sie wie zuvor gezeigt. Zentrifugieren Sie dann die Mikrotiterplatte.
Waschen Sie das Reagenz zur Erkennung überschüssiger Spike dreimal mit 60 Mikrolitern PBST von den Kügelchen. Als nächstes bereiten Sie eine Fluoreszenzlösung vor, die aus PE-konjugiertem Anti-Human-Immunglobulin G zusammen mit strahlendem Violett für 21 konjugierte Anti-FLAG-Antikörper besteht. Geben Sie 50 Mikroliter Fluoreszenzlösungsmischung pro Vertiefung zu den gewaschenen Mikrosphären und inkubieren Sie wie zuvor gezeigt.
Schleudern Sie dann die Mikrotiterplatte nach unten. Waschen Sie die überschüssige fluoreszierende Lösungsmischung von den Mikrosphären mit 60 Mikrolitern PBST. Suspendieren Sie die Mikrosphären in 60 Mikrolitern PBST aus dem letzten Waschschritt.
Analysieren Sie dann die Platte auf einem Dual-Reporter-Strömungsanalysesystem mit den gewünschten Einstellungen. Bei der Verdünnung von SARS-CoV-2-infizierten Zellüberständen in beiden Reporterkanälen wurde ein konzentrationsabhängiges Signal beobachtet. Drei der fünf einkettigen variablen Fragmente können das Virus in einer Verdünnung von nur eins bis 18 nachweisen.
Für die verbleibenden zwei einkettigen variablen Fragmente ist das Virus in Verdünnungen von nur eins bis sechs nachweisbar.
