परख बफर तैयार करने के लिए पीएच सात के साथ कैसिइन, पॉलीविनाइल अल्कोहल, पॉलीविनाइलपीरोलिडोन और बीएसए मिश्रण करके शुरू करें। अगला, नमूना कमजोर पड़ने बफर बनाने के लिए परख बफर में 10% खरगोश इम्युनोग्लोबुलिन जी तैयार करें। परीक्षण के लिए आवश्यक काम कर मनका मिश्रण की मात्रा तैयार करें.
फिर तैयार SARS-CoV-2 को पिघलाएं और एक घंटे के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर सुपरनेटेंट को नियंत्रित करें। SARS-CoV-1.5 के लिए प्रत्येक में आठ 2-मिलीलीटर माइक्रोफ्यूज ट्यूबों को लेबल और व्यवस्थित करें और सुपरनेटेंट को नियंत्रित करें। प्रत्येक सतह पर तैरनेवाला के उच्चतम कमजोर पड़ने बनाने के लिए, उचित लेबल ट्यूबों में नमूना कमजोर पड़ने बफर के साथ सतह पर तैरनेवाला के 600 माइक्रोलीटर गठबंधन, संक्षेप में मिश्रण करने के लिए ट्यूब भंवर द्वारा पीछा किया.
क्रमिक रूप से एक के 400 माइक्रोलीटर को एक पतला सतह पर तैरनेवाला को अगले कमजोर पड़ने वाली ट्यूब में स्थानांतरित करें। संक्षेप में भंवर प्रत्येक पतला सतह पर तैरनेवाला अगले कमजोर पड़ने के साथ आगे बढ़ने से पहले. फिर 30 सेकंड के लिए भंवर के बाद पहले से तैयार काम मनका मिश्रण ले लो और एक फ्लैट नीचे, 384 अच्छी तरह से microtiter थाली के प्रत्येक सौंपा अच्छी तरह से पांच माइक्रोलीटर जोड़ें.
384 अच्छी तरह से थाली में microspheres युक्त सौंपा कुओं के लिए तैयार सतह पर तैरनेवाला कमजोर पड़ने के 45 माइक्रोलीटर जोड़ें. प्लेट को सील करें और कमरे के तापमान पर अंधेरे में 650 आरपीएम पर एक कक्षीय शेकर पर रात भर इनक्यूबेट करें। कक्षीय शेकर से माइक्रोटिटर प्लेट को हटाने के बाद, प्लेट को एक मिनट के लिए 931 ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें।
फिर प्लेट सीलर को हटा दें। मोतियों को स्थिर करने के लिए, माइक्रोटिटर प्लेट को चुंबकीय प्लेट विभाजक पर 30 सेकंड के लिए रखें। माइक्रोटिटर प्लेट के साथ अभी भी चुंबकीय विभाजक पर स्थित है, चुंबक स्थिर मोतियों से सतह पर तैरनेवाला महाप्राण है।
चुंबकीय विभाजक से माइक्रोटिटर प्लेट को हटाने के बाद, प्रत्येक मनका युक्त अच्छी तरह से पीबीएसटी के 60 माइक्रोलीटर जोड़ें। अगला, अलग पहचान घोला जा सकता है तैयार करने के लिए पांच 1.5 मिलीलीटर ट्यूब ले. प्रत्येक ट्यूब में SARS-CoV-1 कण पर स्पाइक प्रोटीन को लक्षित करने वाले मानव मोनोक्लोनल एंटी-S1 एंटीबॉडी और FLAG-टैग किए गए, सिंगल-चेन वेरिएबल टुकड़े जोड़ें।
धोया microspheres के लिए उपयुक्त एकल श्रृंखला, चर टुकड़ा विशिष्ट, कील का पता लगाने मिश्रण के अच्छी तरह से प्रति 50 माइक्रोलीटर जोड़ें. माइक्रोटिटर प्लेट को सील करें और इनक्यूबेट करें जैसा कि पहले दिखाया गया है। फिर माइक्रोटिटर प्लेट को सेंट्रीफ्यूज करें।
तीन बार पीबीएसटी के 60 माइक्रोलीटर के साथ मोतियों से अतिरिक्त स्पाइक डिटेक्शन अभिकर्मक धो लें। इसके बाद, 21 संयुग्मित एंटी-फ्लैग एंटीबॉडी के लिए शानदार वायलेट के साथ पीई-संयुग्मित, एंटी-ह्यूमन इम्युनोग्लोबुलिन जी से मिलकर एक फ्लोरोसेंट समाधान तैयार करें। धोया microspheres फ्लोरोसेंट समाधान मिश्रण के अच्छी तरह से प्रति 50 माइक्रोलीटर जोड़ें, और सेते हैं के रूप में पहले दिखाया गया है.
फिर माइक्रोटिटर प्लेट को नीचे घुमाएं। पीबीएसटी के 60 माइक्रोलीटर के साथ microspheres से अतिरिक्त फ्लोरोसेंट समाधान मिश्रण धो लें. अंतिम धोने के चरण से पीबीएसटी के 60 माइक्रोलीटर में माइक्रोसेफर्स को निलंबित करें।
फिर वांछित सेटिंग्स के साथ एक दोहरी रिपोर्टर प्रवाह विश्लेषण प्रणाली पर थाली का विश्लेषण. दोनों रिपोर्टर चैनलों में SARS-CoV-2-संक्रमित सेल सुपरनेटेंट के कमजोर पड़ने में, एक एकाग्रता-निर्भर संकेत देखा गया था। पांच एकल-श्रृंखला चर टुकड़ों में से तीन कमजोर पड़ने में वायरस का पता लगा सकते हैं जो एक से 18 तक कम है।
शेष दो एकल-श्रृंखला चर टुकड़ों के लिए, वायरस एक से छह तक कम कमजोर पड़ने में पता लगाने योग्य है।
