Iniziare mescolando caseina, alcol polivinilico, polivinilpirrolidone e BSA con pH sette per preparare il tampone del saggio. Successivamente, preparare l'immunoglobulina G di coniglio al 10% nel tampone di saggio per creare il tampone di diluizione del campione. Preparare il volume della miscela di perline di lavoro necessaria per il test.
Quindi scongelare il SARS-CoV-2 preparato e controllare i surnatanti a quattro gradi Celsius per un'ora. Etichettare e sistemare otto provette per microfughe da 1,5 millilitri ciascuna per SARS-CoV-2 e surnatanti di controllo. Per ottenere la massima diluizione di ciascun surnatante, combinare 600 microlitri di surnatante con il tampone di diluizione del campione in provette opportunamente etichettate, quindi agitare brevemente la provetta per mescolare.
Trasferire in sequenza 400 microlitri di quello è a un surnatante diluito alla provetta di diluizione successiva. Agitare brevemente ogni surnatante diluito prima di procedere con la diluizione successiva. Quindi prelevare la miscela di perle di lavoro pre-preparata dopo aver agitato per 30 secondi e aggiungere cinque microlitri a ciascun pozzetto assegnato di una piastra per microtitolazione a fondo piatto da 384 pozzetti.
Aggiungere 45 microlitri della diluizione del surnatante preparata ai pozzetti assegnati contenenti microsfere nella piastra a 384 pozzetti. Sigillare la piastra e incubare per una notte su un agitatore orbitale a 650 giri/min al buio a temperatura ambiente. Dopo aver rimosso la piastra per microtitolazione dall'agitatore orbitale, centrifugare la piastra a 931 g per un minuto.
Quindi rimuovere il sigillante per piastre. Per immobilizzare le perline, posizionare la piastra per microtitolazione su un separatore magnetico per 30 secondi. Con la piastra per microtitolazione ancora posizionata sul separatore magnetico, aspirare il surnatante dalle perle immobilizzate con il magnete.
Dopo aver rimosso la piastra di microtitolazione dal separatore magnetico, aggiungere 60 microlitri di PBST a ciascun pozzetto contenente microsfere. Quindi, prelevare cinque provette da 1,5 millilitri per preparare diverse miscele di rilevamento. Aggiungere a ciascuna provetta l'anticorpo monoclonale umano anti-S1 e i frammenti variabili a catena singola marcati con FLAG che hanno come bersaglio la proteina spike sulla particella SARS-CoV-2.
Aggiungere 50 microlitri per pozzetto della miscela appropriata a catena singola, specifica per frammento variabile, per il rilevamento di picchi alle microsfere lavate. Sigillare la piastra per microtitolazione e incubare come mostrato in precedenza. Quindi centrifugare la piastra per microtitolazione.
Lavare tre volte il reagente per il rilevamento delle punte in eccesso dalle microsfere con 60 microlitri di PBST. Successivamente, preparare una soluzione fluorescente costituita da immunoglobulina G anti-umana coniugata con PE insieme a viola brillante per 21 anticorpi anti-FLAG coniugati. Aggiungere 50 microlitri per pozzetto di miscela di soluzione fluorescente alle microsfere lavate e incubare come mostrato in precedenza.
Quindi ruotare la piastra per microtitolazione. Lavare la miscela di soluzione fluorescente in eccesso dalle microsfere con 60 microlitri di PBST. Sospendi le microsfere in 60 microlitri di PBST dall'ultima fase di lavaggio.
Quindi analizzare la piastra su un sistema di analisi del flusso a doppio reporter con le impostazioni desiderate. Nella diluizione dei surnatanti cellulari infettati da SARS-CoV-2 in entrambi i canali reporter, è stato osservato un segnale concentrazione-dipendente. Tre dei cinque frammenti variabili a catena singola possono rilevare il virus in una diluizione da uno a 18.
Per i restanti due frammenti variabili a catena singola, il virus è rilevabile in diluizioni da una a sei.
