SARS-CoV-2感染Vero E6細胞上清中のSARS-CoV-2ウイルス粒子の検出

まず、カゼイン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、BSAをpH 7と混合して、アッセイバッファーを調製します。次に、アッセイバッファーに10%ウサギ免疫グロブリンGを調製して、サンプル希釈バッファーを調製します。試験に必要な作業ビーズ混合物の量を準備します。

次に、準備したSARS-CoV-2を解凍し、上清を摂氏4度で1時間制御します。SARS-CoV-2用にそれぞれ8本の1.5ミリリットルマイクロフュージチューブを標識して配置し、上清を制御します。各上清の最高希釈率を作成するには、600マイクロリットルの上清をサンプル希釈バッファーと適切に標識されたチューブに組み合わせ、その後、チューブを短時間ボルテックスして混合します。

1つの希釈上清に1つの希釈液の400マイクロリットルを順次移し、次の希釈チューブに移します。希釈した各上清を短時間ボルテックスしてから、次の希釈に進みます。次に、30秒間ボルテックスした後、事前に調製した作業用ビーズ混合物を取り、平底の384ウェルマイクロタイタープレートの各割り当てられたウェルに5マイクロリットルを追加します。

調製した上清希釈液の45マイクロリットルを、384ウェルプレートのマイクロスフェアを含む割り当てられたウェルに加えます。プレートをシールし、室温の暗闇で650 RPMのオービタルシェーカーで一晩インキュベートします。マイクロタイタープレートをオービタルシェーカーから取り出した後、プレートを931gで1分間遠心分離します。

次に、プレートシーラーを取り外します。ビーズを固定するには、マイクロタイタープレートを磁気プレートセパレーターに30秒間置きます。マイクロタイタープレートを磁気セパレーターに置いたまま、磁石固定ビーズから上清を吸引します。

マイクロタイタープレートをマグネティックセパレーターから取り出した後、各ビーズ含有ウェルに60マイクロリットルのPBSTを加えます。次に、1.5ミリリットルのチューブを5本取り、さまざまな検出ミックスを調製します。ヒトモノクローナル抗S1抗体と、SARS-CoV-2粒子のスパイクタンパク質を標的とするFLAGタグ付き一本鎖可変フラグメントを各チューブに加えます。

洗浄したマイクロスフェアに、適切な一本鎖可変フラグメント特異的スパイク検出ミックスのウェルあたり50マイクロリットルを加えます。マイクロタイタープレートを密封し、前述したようにインキュベートします。次に、マイクロタイタープレートを遠心分離します。

ビーズから余分なスパイク検出試薬を60マイクロリットルのPBSTで3回洗浄します。次に、PE標識抗ヒト免疫グロブリンGとブリリアントバイオレットからなる蛍光溶液を調製します。洗浄したミクロスフェアに蛍光溶液混合物のウェルあたり50マイクロリットルを加え、先に示すようにインキュベートします。

次に、マイクロタイタープレートをスピンダウンします。ミクロスフェアから余分な蛍光溶液混合物を60マイクロリットルのPBSTで洗い流します。最後の洗浄ステップから60マイクロリットルのPBSTにマイクロスフィアを懸濁します。

次に、デュアルレポーターフロー解析システムでプレートを必要な設定で分析します。SARS-CoV-2感染細胞上清を両レポーターチャネルで希釈すると、濃度依存的なシグナルが観察されました。5つの一本鎖可変フラグメントのうち3つは、1〜18の希釈でウイルスを検出できます。

残りの2つの一本鎖可変フラグメントについては、ウイルスは1〜6の希釈で検出可能です。