Comece misturando caseína, álcool polivinílico, polivinilpirrolidona e BSA com pH sete para preparar o tampão do ensaio. Em seguida, prepare a imunoglobulina G de coelho a 10% em tampão de ensaio para fazer o tampão de diluição da amostra. Preparar o volume da mistura de esferas de trabalho necessário para o ensaio.
Em seguida, descongele o SARS-CoV-2 preparado e controle os sobrenadantes a quatro graus Celsius por uma hora. Rotule e organize oito tubos de microcentrífugas de 1,5 mililitro cada um para SARS-CoV-2 e sobrenadantes de controle. Para criar a diluição mais alta de cada sobrenadante, combine 600 microlitros do sobrenadante com o tampão de diluição da amostra em tubos devidamente marcados, seguido de um breve vórtice do tubo para misturar.
Transferir sequencialmente 400 microlitros do sobrenadante de um é para um sobrenadante diluído para o tubo de diluição seguinte. Vortex breve de cada sobrenadante diluído antes de prosseguir com a próxima diluição. Em seguida, pegue a mistura de grânulos de trabalho pré-preparada após o vórtice por 30 segundos e adicione cinco microlitros a cada poço atribuído de uma placa de microtitulação de fundo plano de 384 poços.
Adicione 45 microlitros da diluição do sobrenadante preparada aos poços designados contendo microesferas na placa de 384 poços. Sele a placa e incube durante a noite em um agitador orbital a 650 RPM no escuro à temperatura ambiente. Depois de remover a placa de microtitulação do agitador orbital, centrifugue a placa a 931g por um minuto.
Em seguida, remova o selador de placas. Para imobilizar as contas, coloque a placa de microtitulação em um separador de placa magnética por 30 segundos. Com a placa de microtitulação ainda posicionada no separador magnético, aspirar o sobrenadante dos grânulos imobilizados por ímã.
Depois de remover a placa de microtitulação do separador magnético, adicione 60 microlitros de PBST a cada poço contendo esferas. Em seguida, pegue cinco tubos de 1,5 mililitro para preparar diferentes misturas de detecção. Adicione anticorpo monoclonal humano anti-S1 e fragmentos variáveis de cadeia única marcados com FLAG direcionados à proteína spike na partícula SARS-CoV-2 a cada tubo.
Adicione 50 microlitros por poço da mistura apropriada de cadeia única, específica para fragmentos variáveis e detecção de picos às microesferas lavadas. Sele a placa de microtitulação e incube conforme mostrado anteriormente. Em seguida, centrifugue a placa de microtitulação.
Lave o excesso de reagente de detecção de picos dos grânulos com 60 microlitros de PBST três vezes. Em seguida, prepare uma solução fluorescente consistindo de imunoglobulina G anti-humana conjugada com PE junto com violeta brilhante para 21 anticorpos anti-FLAG conjugados. Adicione 50 microlitros por poço de mistura de solução fluorescente às microesferas lavadas e incube conforme mostrado anteriormente.
Em seguida, gire para baixo a placa de microtitulação. Lave o excesso de mistura de solução fluorescente das microesferas com 60 microlitros de PBST. Suspenda as microesferas em 60 microlitros de PBST a partir da última etapa de lavagem.
Em seguida, analise a placa em um sistema de análise de fluxo de repórter duplo com as configurações desejadas. Na diluição de sobrenadantes de células infectadas por SARS-CoV-2 em ambos os canais repórteres, foi observado um sinal dependente da concentração. Três dos cinco fragmentos variáveis de cadeia única podem detectar o vírus em diluições tão baixas quanto um a 18.
Para os dois fragmentos variáveis de cadeia única restantes, o vírus é detectável em diluições tão baixas quanto um a seis.
