Börja med att blanda kasein, polyvinylalkohol, polyvinylpyrrolidon och BSA med pH sju för att förbereda analysbufferten. Förbered sedan 10% kaninimmunglobulin G i analysbuffert för att göra provets utspädningsbuffert. Förbered volymen av den arbetspärlblandning som krävs för testning.
Tina sedan upp den beredda SARS-CoV-2 och kontrollera supernatanterna vid fyra grader Celsius i en timme. Märk och ordna åtta 1,5-milliliters mikrofugerör vardera för SARS-CoV-2 och kontrollera supernatanter. För att skapa den högsta utspädningen av varje supernatant, kombinera 600 mikroliter supernatant med provspädningsbufferten i lämpligt märkta rör, följt av en kort vortexing av röret för att blanda.
Överför sekventiellt 400 mikroliter av det ena är till en utspädd supernatant till nästa utspädningsrör. Virvla kort varje utspädd supernatant innan du fortsätter med nästa spädning. Ta sedan den förberedda arbetspärlblandningen efter vortexing i 30 sekunder och tillsätt fem mikroliter till varje tilldelad brunn på en plattbottnad mikrotiterplatta med 384 brunnar.
Tillsätt 45 mikroliter av den beredda supernatantutspädningen till tilldelade brunnar som innehåller mikrosfärer i plattan med 384 brunnar. Försegla plattan och inkubera över natten på en orbital shaker vid 650 RPM i mörker vid rumstemperatur. Efter att ha tagit bort mikrotiterplattan från orbitalshakern, centrifugera plattan vid 931 g i en minut.
Ta sedan bort plattförseglaren. För att immobilisera pärlorna, placera mikrotiterplattan på en magnetisk plattseparator i 30 sekunder. Med mikrotiterplattan fortfarande placerad på den magnetiska separatorn, aspirera supernatanten från magnetimmobiliserade pärlor.
Efter att ha tagit bort mikrotiterplattan från den magnetiska separatorn, tillsätt 60 mikroliter PBST till varje pärlhaltig brunn. Ta sedan fem rör på 1,5 milliliter för att förbereda olika detektionsblandningar. Tillsätt humana monoklonala anti-S1-antikroppar och FLAG-märkta, enkelkedjiga variabla fragment som riktar sig mot spikproteinet på SARS-CoV-2-partikeln till varje rör.
Tillsätt 50 mikroliter per brunn av den lämpliga enkelkedjiga, variabelt fragmentspecifika, spikdetektionsblandningen till de tvättade mikrosfärerna. Försegla mikrotiterplattan och inkubera som bilden tidigare. Centrifugera sedan mikrotiterplattan.
Tvätta överflödigt spikdetekteringsreagens från pärlor med 60 mikroliter PBST tre gånger. Bered därefter en fluorescerande lösning bestående av PE-konjugerat, antihumant immunglobulin G tillsammans med briljantviolett för 21 konjugerade anti-FLAG-antikroppar. Tillsätt 50 mikroliter per brunn av fluorescerande lösningsblandning till de tvättade mikrosfärerna och inkubera som visats tidigare.
Snurra sedan ner mikrotiterplattan. Tvätta bort överflödig fluorescerande lösningsblandning från mikrosfärerna med 60 mikroliter PBST. Suspendera mikrosfärerna i 60 mikroliter PBST från det sista tvättsteget.
Analysera sedan plattan på ett flödesanalyssystem med dubbla rapportörer med önskade inställningar. I utspädningen av SARS-CoV-2-infekterade cellsupernatanter i båda rapportörskanalerna observerades en koncentrationsberoende signal. Tre av de fem enkelkedjiga variabla fragmenten kan detektera viruset i en spädning så låg som ett till 18.
För de återstående två enkelkedjiga variabla fragmenten kan viruset detekteras i spädningar så låga som en till sex.
