Til at begynde med skal du samle de optøede prøver af salmonella-inficeret murineret musevæv op med en pincet. Indsæt den hurtigt i bunden af en plastform, der indeholder flydende agarose. Når polymerisationen er afsluttet, skal du bruge en skalpel til at åbne plastformen fra hjørnerne.
Efter at have placeret et blad på et mikrotom, overfør prøven med handskede fingre til en prøveboks. Prøven anbringes under mikrotomet, således at agarosens øverste overflade er på samme niveau som mikrotomets blad. Flyt scenen for at placere agarose-terningen i midten af målet.
Klik på knappen Slice i tomografsoftwaren, indtil en hel intakt skive af terningen er opnået. Centrer derefter objektivlinsen på vævsprøven i x- og y-retninger. Start lasersoftwaren, juster bølgelængden til 800 nanometer, og tænd derefter for laseren.
Luk skabsdørene til mikroskopet. Sluk derefter for alle lyskilder i rummet. Tænd for PMT'erne, og indstil spændingen til 750 volt.
Indstil nu mikroskoplukkeren til automatisk. Indstil derefter spændingerne på V1 og V2 til henholdsvis 20 og 1.71. Juster z-aksen med z-piezo-enheden, indtil den når vævsoverfladen.
Skær flere skiver med en tykkelse på 50 mikrometer. Dernæst for at finde prøvekanterne skal du begrænse billeddannelsesområdet til vævet med minimal billeddannelse af den omgivende agarose. Efter at have slukket for PMT'erne, skal du indstille laserbølgelængden til 800 nanometer.
Brug laserpunktet til at finde koordinaterne for vævskanterne, mens du flytter scenen. Efter bekræftelse af koordinaterne skal du placere laserpunktet til højre foran midten. Skift nu bølgelængden til 940 nanometer.
Indstil mikroskoplukkeren til automatisk tilstand, og indstil derefter lukkerspændingen til 20 for V1 og 1.71 for V2. Tryk på indstillingen 3D Mosaic for at starte scanningen. Efter billeddannelse skal du samle vævssektionerne fra vandtanken. For at sy flisebillederne skal du først overføre data fra tomografserveren til Linux-computeren.
Åbn MATLAB-scriptet StepOneStitchingAndArchive. m og find kildemappen. Skift til fanen Editor, og klik på Kør.
Statusoplysningerne vil blive vist i kommandovinduet. Find de sammensatte billeder i undermappen kaldet stitchedimages_100 i kildemappen. Komprimer rådataene ved hjælp af tar-kommandoen, og gem dem som en enkelt fil med filtypenavnet tar.bz2.
For at træne den understøttende vektormaskine skal du forhåndsvise de sammensatte billeder. Åbn et billede med samme filnavn fra hver undermappe med Fiji. Flet de tre kanaler sammen til et farvebillede, og juster derefter lysstyrken på hver kanal, indtil der ses klare signaler fra bakterier og vævsautofluorescens.
Bemærk det justerede maksimale intensitetsniveau for hver kanal. Åbn derefter MATLAB-scriptet StepTwoSegmentationAndAnalysis.m. Definer kildemappen og billednavnene til træning, gå derefter til fanen Editor og klik på Kør.
Når der vises en dialogboks, der beder om farvetærskler, skal du udfylde den med de værdier, der er baseret på den tidligere manuelle kontrol med Fiji. Vælg regioner til baggrund og områder af interesse i henhold til dialogerne. Der vises grafer, der viser, hvor godt modellen er blevet trænet, og spørger, om der skal tilføjes flere regioner.
Tilføj flere områder af interesse og baggrund, indtil bakterierne kan segmenteres tydeligt. Segmenteringsprocessen kører automatisk, og fremskridtene kan ses i kommandovinduet. Åbn derefter de blå kanalbilleder, som indeholder andre harmoniske signaler af kollagen.
Bøj de første kanalbilleder ti gange i både x- og y-akser, og gem de reducerede billeder i en ny mappe. Lav tre replikater af forringede billeder i samme mappe. Til 3D-visualiseringen skal du starte Imaris-visualiseringssoftwarepakken i Arena-visningen.
Åbn nu IMS- eller TIF-filen. Juster farvegengivelserne for de forskellige kanaler i displayjusteringsvinduet. Klik på Billedegenskaber under menuen Rediger for manuelt at indstille minimums- eller maksimumværdierne og en værdi for gammakorrektion.
Når du har justeret billedets udseende, skal du eksportere den aktuelle visning ved hjælp af snapshotværktøjet. Brug navigationsmarkøren til at finde en visning, og brug derefter Plus Tilføj til at tilføje nøglerammer. Brug animationsikonet til at repræsentere 3D-dataene som en film.
Tryk på den røde optageknap for at oprette filmen, og gem den derefter i den ønskede destinationsmappe og filtype. Individuelle Salmonella-celler blev påvist i hele museorganer, såsom milt, lever, mesenteriske lymfeknuder og Peyers pletter. Segmentering af fluorescerende bakterier blev bekræftet ved immunhistokemi.
Værtsceller blev farvet in vivo ved at injicere et antistof til overflademarkører før perfusion.