Begin met het uitvoeren van de MM QPCR-test voor het meten van de telomeerlengte. Open vervolgens de software en selecteer de functie voor het instellen van de plaat. Kies daarna de optie Plaat bekijken of bewerken in het vervolgkeuzemenu.
Markeer nu alle kuiltjes op het bord. Klik op floraforen selecteren. Vink het vakje met het label cyber aan en zorg ervoor dat alle andere vakjes zijn uitgeschakeld.
Klik vervolgens op OK om te bevestigen. Terwijl u de markering op alle putten behoudt, zoekt u het vakje naast cyber, naast het woord belasting en vinkt u het vakje aan om alle putten met cyber te labelen. Markeer nu de drie niet-sjablooncontroleputten die zich aan de boven- of onderkant van de standaard seriële controleverdunning bevinden.
Selecteer vervolgens in het menu met voorbeeldtypen aan de rechterkant de optie NTC. Markeer de 21 putjes waaruit de standaardseriële controleverdunning bestaat en kies standaard uit het menu met monstertypen. Terwijl deze putten nog steeds zijn geselecteerd, klikt u op technisch repliceren, in het menu replicatiegrootte kiest u er drie.
Selecteer vervolgens horizontaal en klik op toepassen. Scrol daarna omlaag naar het gedeelte over de verdunningsreeks en voer er twee in het veld voor de verdunningsfactor in. Voer voor de P1-plaat twee keer 10 in tot de macht min drie in het startconcentratieveld.
Selecteer vervolgens het vakje voor verlagen en klik op toepassen om de instellingen te bevestigen. Voor de P2-plaat voert u 3,13 keer 10 tot de macht min vijf in het startconcentratieveld in. Zorg ervoor dat u het vakje voor verhogen aanvinkt en selecteer vervolgens toepassen om de installatie af te ronden.
Markeer nu de kolommen die overeenkomen met PCR-strip A in het menu met het monstertype, kies onbekend en ga vervolgens verder met het selecteren van technisch repliceren. Kies er drie in het menu voor het repliceren van grootte en kies voor horizontaal voordat u op toepassen klikt. Klik op OK rechtsonder in het venster van de plaateditor.
Bevestig de wijzigingen door op ja te klikken wanneer daarom wordt gevraagd. Controleer vervolgens of de curven op het tabblad Kwantificering geschikt lijken voor zowel stap negen als stap 12, en of de efficiëntiewaarden tussen deze twee stappen niet meer dan 10% uiteenlopenSelecteer stap negen voor P1 en markeer de 21 putten die overeenkomen met de standaardcurve. Kopieer de CQ-waarden uit de rechterbenedenhoek van het softwarevenster.
Open vervolgens de sjabloon voor het telomeergegevensblad en plak deze waarden in de standaardkolom B. Voer daarna de hellingswaarde van stap negen in cel C vier in het standaardblad in en controleer of de variatiecoëfficiënt voor elk standaard verdunningsdrievoud lager is dan 0.1. Sluit op CFX alle uitschieters uit van de analyse die ervoor zorgen dat een set drievouden buiten bereik valt. Controleer nu of alleen de 72 monsterputten in het P1-analysebestand blauw zijn gemarkeerd op het tabblad Kwantificering.
Kopieer vervolgens in stap negen de CQ- en SQ-waarden in de rechterbenedenhoek van het softwarevenster en plak ze in het voorbeeldblad P1, beginnend bij cel D3. Zorg er met behulp van CFX maestro voor dat alle CQ-waarden voor analytische monsters binnen het bereik van de laagste en hoogste CQ-waarden van de standaardcurve liggen. Controleer in de Excel-sheet dat de startconcentratie in de NTC minder is dan 5% van de gemiddelde hoeveelheid DNA in de monsterputjes. Voor de kwaliteitscontrole op monsterniveau onderzoekt u de standaarddeviaties en de variatiecoëfficiënt in de kolommen J en K op de monsterbladen P1 en P2.
Controleer of de CV's van de afzonderlijke tussenplaten van het monster in de plaat P1 versus P2, met name in kolom G, niet groter zijn dan 0,05. Als de CV tussen de platen van een monster hoger is dan acceptabel, verwijder dan maximaal één drievoud uit de berekening voor elk monster. Controleer voor de kwaliteitscontrole op plaatniveau of de gemiddelde variatie tussen de platen in alle monsters op elke plaat minder dan 0,05 is.
Als de CV tussen de platen van een monster hoger is dan acceptabel, verwijder dan maximaal één drievoud uit de berekening voor elk monster. Controleer voor extra kwaliteitscontrole op plaatniveau of de totale variatie tussen de platen tussen P1 en P2 minder dan 0,06 is.
