まず、テロメア長測定のためのMM QPCRアッセイを実施します。次に、ソフトウェアを開き、プレートセットアップ機能を選択します。その後、ドロップダウンメニューからプレートの表示または編集オプションを選択します。
次に、プレート上のすべてのウェルを強調表示します。「フローラフォアを選択」をクリックします。「cyber」というラベルの付いたボックスにチェックを入れ、他のすべてのボックスがオフになっていることを確認します。
次に、[OK]をクリックして確認します。すべてのウェルのハイライトを維持しながら、 サイバー 単語の横、 ロード すべてのウェルにサイバーのラベルを付けるためのボックスを見つけてチェックします。次に、標準コントロール逐次希釈の上部または下部に配置された3つの非テンプレートコントロールウェルを強調表示します。
次に、右側のサンプルタイプメニューからNTCを選択します。標準コントロール連続希釈を構成する21個のウェルを強調表示し、サンプルタイプメニューから標準を選択します。これらのウェルがまだ選択されている間に、テクニカルレプリケートをクリックし、レプリケートサイズメニューで3つを選択します。
次に、[水平]を選択し、[適用]をクリックします。その後、希釈系列セクションまでスクロールし、希釈係数フィールドに2を入力します。P1プレートの場合、開始濃度フィールドに10の2倍を負の3の累乗に入力します。
次に、減少するボックスを選択し、[適用]をクリックして設定を確定します。P2プレートの場合、開始濃度フィールドに3.13×10の負5乗を入力します。増加のチェックボックスをオンにし、[適用] を選択してセットアップを完了します。
次に、サンプルタイプメニューからPCRストリップAに対応する列を強調表示し、[unknown]を選択してから、[technical replicate]を選択します。[レプリケート サイズ] メニューで 3 つ選択し、水平を選択してから [適用] をクリックします。プレートエディタウィンドウの右下にある[OK]をクリックします。
プロンプトが表示されたら「はい」をクリックして、変更を確認します。次に、[定量]タブの曲線がステップ9とステップ12の両方に適切であること、およびこれら2つのステップ間の効率値が10%以上乖離していないことを確認します。P1の場合は、ステップ9を選択し、標準曲線に対応する21ウェルを強調表示します。ソフトウェアウィンドウの右下隅から CQ 値をコピーします。
次に、テロメアのデータシートテンプレートを開き、これらの値を標準の1シートの列B.に貼り付けます。その後、ステップ9の傾き値を標準の1シートのセルC 4に入力し、各標準希釈トリプリケートの変動係数が0.1未満であることを確認します。CFX では、一連の 3 つの変数が範囲外になる外れ値データ ポイントを分析から除外します。次に、P1分析ファイル内の72個のサンプルウェルのみが定量タブで青色で強調表示されていることを確認します。
次に、手順 9 で、ソフトウェアウィンドウの右下隅にある CQ 値と SQ 値をコピーし、セル D3 から始まるサンプル P1 シートに貼り付けます。CFX maestroを使用して、分析サンプルのすべてのCQ値が標準曲線の最低CQ値と最高CQ値の範囲内にあることを確認します。Excelシートで、NTCの開始濃度がサンプルウェル内のDNAの平均量の5%未満であることを確認します。サンプルレベルの品質管理のために、サンプルP1およびP2シートの列JおよびKの標準偏差と変動係数を調べます。
P1 シートと P2 シートの個々のサンプルプレート間 CV (特に列 G ) が 0.05 を超えていないことを確認します。サンプルのプレート間CVが許容範囲を超えている場合は、各サンプルの計算から最大1つのトリプリケートを削除します。プレートレベルの品質管理では、各プレート上のすべてのサンプルの平均プレート間変動が0.05未満であることを確認してください。
サンプルのプレート間CVが許容範囲を超えている場合は、各サンプルの計算から最大1つのトリプリケートを削除します。追加のプレートレベルの品質管理のために、P1 シートと P2 シートの全体的なプレート間変動が 0.06 未満であることを確認してください。
