Comience realizando el ensayo MM QPCR para la medición de la longitud de los telómeros. A continuación, abra el software y seleccione la función de configuración de la placa. Después de eso, elija la opción ver o editar placa en el menú desplegable.
Ahora resalta todos los pozos del plato. Haga clic en seleccionar floróforos. Marque la casilla etiquetada como cibernética y asegúrese de que todas las demás casillas estén desmarcadas.
A continuación, haga clic en Aceptar para confirmar. Mientras mantiene el resaltado en todos los pozos, ubique y marque la casilla junto a cyber, junto a la palabra cargar para etiquetar todos los pozos con cyber. Ahora resalte los tres pozos de control no molde colocados en la parte superior o inferior de la dilución en serie de control estándar.
A continuación, en el menú de tipo de muestra de la derecha, seleccione NTC. Resalte los 21 pocillos que componen la dilución en serie de control estándar y elija el estándar en el menú de tipo de muestra. Mientras estos pozos aún están seleccionados, haga clic en replicar técnicamente, en el menú tamaño de réplica, elija tres.
A continuación, seleccione horizontal y haga clic en aplicar. Después de eso, desplácese hacia abajo hasta la sección de la serie de dilución e ingrese dos en el campo del factor de dilución. Para la placa P1, ingrese dos por 10 a la potencia de menos tres en el campo de concentración inicial.
A continuación, seleccione la casilla de disminución y haga clic en aplicar para confirmar la configuración. Para la placa P2, introduzca 3,13 por 10 elevado a menos cinco en el campo de concentración inicial. Asegúrese de marcar la casilla para aumentar y, a continuación, seleccione aplicar para finalizar la configuración.
Ahora resalte las columnas correspondientes a la tira de PCR A en el menú de tipo de muestra, elija desconocido y luego proceda a seleccionar la réplica técnica. En el menú de tamaño de réplica, elija tres y opte por horizontal antes de hacer clic en aplicar. Haga clic en Aceptar en la parte inferior derecha de la ventana del editor de placas.
Confirme los cambios haciendo clic en Sí cuando se le solicite. A continuación, verifique que las curvas de la pestaña de cuantificación parezcan apropiadas tanto para el paso nueve como para el paso 12, y que los valores de eficiencia entre estos dos pasos no diverjan en más del 10%Para P1, seleccione el paso nueve y resalte los 21 pozos correspondientes a la curva estándar. Copie los valores de CQ desde la esquina inferior derecha de la ventana del software.
Luego abra la plantilla de hoja de datos de telómeros y pegue estos valores en la columna estándar de una hoja B.Luego, ingrese el valor de pendiente del paso nueve en la celda C cuatro en la hoja estándar uno, verifique que el coeficiente de variación para cada triplicado de dilución estándar esté por debajo de 0.1. En CFX, excluya cualquier punto de datos atípico del análisis que haga que un conjunto de triplicados quede fuera del rango. Ahora, confirme que solo los 72 pozos de muestra en el archivo de análisis P1 están resaltados en azul en la pestaña de cuantificación.
Luego, en el paso nueve, copie los valores CQ y SQ que se encuentran en la esquina inferior derecha de la ventana del software y péguelos en la hoja P1 de muestra comenzando en la celda D3. Con CFX maestro, asegúrese de que todos los valores de CQ de las muestras analíticas estén dentro del rango de los valores de CQ más bajos y más altos de la curva estándar. En la hoja de Excel, verifique que la concentración inicial en el NTC sea inferior al 5% de la cantidad promedio de ADN en los pocillos de muestra. Para el control de calidad a nivel de muestra, examine las desviaciones estándar y el coeficiente de variación en las columnas J y K en las hojas P1 y P2 de las muestras.
Verifique que las CV de la muestra individual entre placas en la hoja P1 frente a la P2, específicamente en la columna G, no superen 0,05. Si el CV entre placas de una muestra es superior al aceptable, elimine hasta un triplicado del cálculo para cada muestra. Para el control de calidad a nivel de placa, compruebe que la variación media entre placas en todas las muestras de cada placa sea inferior a 0,05.
Si el CV entre placas de una muestra es superior al aceptable, elimine hasta un triplicado del cálculo para cada muestra. Para un control de calidad adicional a nivel de placa, compruebe que la variación general entre placas en la hoja P1 frente a la P2 sea inferior a 0,06.
