Beredning av humana meningeala celler (HMC) konditionerade medier och insamling av cerebrospinalvätska för odling av cirkulerande tumörceller

Börja med att belägga en T175-kolv med poly-L-lysin. Placera kolven i en inkubator vid 37 grader Celsius i en timme. Använd nu en steril serologisk pipett för att aspirera lysinlösningen.

Pipettera över 30 ml komplett meningealt odlingsmedium som innehåller humana meningeala celler i kolven. Inkubera cellerna vid 37 grader Celsius under 5%Koldioxidtillskott. När cellerna når cirka 75% till 80% sammanflöde, samla in och spara HMC-odlade medier i ett 50 milliliter koniskt rör.

Tillsätt sedan hela meningealodlingsmediet till röret i förhållandet ett:ett. Slutligen pipetterar du tillväxtfaktorerna in i röret för att skapa det HMC-konditionerade mediet. För att bearbeta den cerebrala ryggmärgsvätskan, placera den först i ett 15 milliliter koniskt rör på is för att kyla den.

Centrifugera vätskan i en förkyld centrifug vid 257 G i fem minuter vid fyra grader Celsius. Pipettera ut supernatanten utan att störa cellpelleten och gör alikvoter av den i olika rör. Tillsätt nu en milliliter PBS till cellpelleten för att sususpendera den.

Centrifugera cellerna vid 1 500 G i fem minuter vid fyra grader Celsius. Aspirera PBS-supernatanten samtidigt som du lämnar cirka 50 mikroliter av den i botten av röret. Utför en cellräkning med cellsuspensionen innan du odlar cellerna.

Flera tillväxtfaktorer uppreglerades i media odlade med humana hjärnhinneceller.