delivering gene therapy vectors via lumbar puncture in the juvenile rat

Lumbar Puncture Delivery of AAV9 in Juvenile Rats for CNS Gene Therapy

The promise of viral-mediated gene therapies has finally been realized in recent years with the FDA approval of treatments for spinal muscular atrophy, retinal dystrophy, factor IX hemophilia, cancer, and more1,2,3,4. Countless other therapeutics are currently in development. Gene therapy aims to deliver a therapeutic gene to a patient&#39;s cells. The products of this new gene can replace the missing activity from a deficient endogenous gene, inhibit a toxic gene, kill cancerous cells, or provide some other beneficial function.
For diseases affecting the central nervous system (CNS), delivering the gene therapy vector directly to the target tissue is often desirable. Non-systemic approaches provide two benefits: they minimize off-target side effects that may be caused by peripheral transduction, and they greatly reduce the amount of vector needed to achieve adequate levels of transduction in the target tissue5.
There are a variety of approaches to delivering gene therapy vectors to the CNS. Intraparenchymal injection, the injection of a vector directly into the spinal cord or brain tissue, can be used for delivery to a defined region. However, for many diseases, broad transduction of the CNS is desired. This can be accomplished by delivering a vector to the cerebrospinal fluid (CSF)5, the fluid that flows in and around the brain and spinal cord. There are three primary ways to deliver vectors to the CSF. The most invasive approach is intracerebroventricular delivery, which involves drilling a burr hole through the skull and advancing a needle through the brain into the lateral ventricles. This yields transduction throughout the brain. However, the procedure may cause intracranial hemorrhage, and the approach generally produces only limited transduction of the spinal cord6. Injection into the cisterna magna at the base of the skull is less invasive, but carries the risk of damage to the brainstem. While often used in animal research5, injection into the cisterna magna is no longer used routinely in the clinic7. Lumbar puncture is the least invasive approach to access the CSF. This involves placing a needle between two lumbar vertebrae and into the lumbar cistern.
Lumbar puncture for vector delivery is routinely performed in adult rats and mice and in neonatal mice8,9. The authors of this study recently performed lumbar punctures in juvenile rats (28-30 days of age) to deliver adeno-associated virus serotype 9 (AAV9) vectors. In adult rats, a neonatal lumbar puncture needle was placed vertically between the L3 and L4 vertebrae9. Proper placement results in a tail flick and CSF flowing up into the needle reservoir. In juvenile rats, though, neither of these read-outs could be achieved. The authors then attempted to adapt an adult mouse procedure using a 27 G insulin syringe inserted at an angle between L5 and L610. In adult mice, which are typically smaller than P28 rats, this does not produce a tail flick, but incorrect needle placement is evident by the backflow of the injectate. In juvenile rats, however, this approach uniformly led to the injectate being delivered epidurally, likely resulting from different elasticity between adult mice and juvenile rats of the tissue layers surrounding the spinal cord. Catheter approaches were evaluated next. Specifically, a catheter was introduced through an incision in the dura of the lumbar cistern and up to the mid-thoracic spinal cord; however, this approach led to substantial reflux of the injectate back out of the incision site during delivery. Attempts to place the catheter into the intrathecal space percutaneously using a guide needle were also unsuccessful. Due to the narrowness of the interlaminar width, the catheter would likely hit the rostral lamina and fail to advance.
Here, a method is described to achieve successful and reproducible solution delivery via a lumbar puncture in the juvenile rat. This approach can be used for viral vectors, and likely also for cells, pharmaceuticals, and other therapeutics.

Author Spotlight: Assessing Intrathecal Gene Therapy Efficacy in Juvenile Rats

Intrathekale Vektorverabreichung bei juvenilen Ratten über die Injektion in die Lendenwirbelsäule

Verabreichung von Gentherapie-Vektoren durch Lumbalpunktion bei juvenilen Ratten

Beginnen Sie damit, das anästhesierte Tier auf der Operationsplattform zu positionieren. Tragen Sie eine befeuchtende Augensalbe auf die Augen jedes Tieres auf, um ein Austrocknen der Hornhaut während der Operation zu verhindern. Desinfizieren Sie die rasierte Operationsstelle mit drei abwechselnden Runden Povidon, Jod und Isopropanol.Positionieren Sie dann eine Rolle Papiertuch oder einen Schlauch mit einem Durchmesser von 1,5 Zentimetern unter dem Tier gerade rostral zu den Hüften. Drapieren Sie das Tier mit einem gefensterten Tuch und zentrieren Sie das Fenster über der Lendenwirbelsäule für den chirurgischen Zugang. Um die Tiefe der Anästhesie beim Tier zu überprüfen, kneifen Sie jede Pfote zusammen und beobachten Sie, ob keine Entzugsreaktion auftritt.Machen Sie dann mit einer Skalpellklinge der Nummer 11 einen drei Zentimeter langen Hautschnitt entlang der Mittellinie von den Wirbeln L2 bis L6. Führen Sie nun eine steril gebogene chirurgische Schere zwischen Muskel und Haut ein und öffnen Sie vorsichtig die Spitzen, um die Haut vom darunter liegenden Muskel zu trennen. Entfernen Sie die Faszie, die die Dornfortsätze der Wirbel L2 bis L5 bedeckt.Pipettieren Sie 25 bis 35 Mikroliter des AAV9-Vektors in den Deckel eines sterilen Mikrozentrifugenröhrchens. Ziehen Sie das gesamte Volumen des Vektors von der Kappe in die Insulinspritze. Identifizieren Sie dann die Dornfortsätze L5 und L4 am Tier.Positionieren Sie die Spritzennadel links vom Dornfortsatz L5 und richten Sie sie mit dem kaudalen Ende des Prozesses aus. Schieben Sie die Spritzennadel etwa acht Millimeter nach vorne über die L5-Lamina und dann unter der L4-Lamina in die Lendenzisterne, bis der Kontakt mit dem Knochen hergestellt ist. Drücken Sie den Spritzenkolben etwa fünf Sekunden lang langsam nieder.Ziehen Sie dann die Nadel langsam von der Einstichstelle zurück. Beginnen Sie mit einer 4-0-Naht oder chirurgischen Klammern, den Schnitt an einem Ende der Wunde zu schließen. Um den Erfolg der Farbstoffinjektion zu bewerten, machen Sie nach dem Einschläfern des Tieres einen vier Zentimeter langen Schnitt in den Muskel, der parallel zur Wirbelsäule auf beiden Seiten der Dornfortsätze verläuft.Verwenden Sie eine Wirbelsäulenzange oder eine Schere, um den Muskel zwischen den Dornfortsätzen vorsichtig zu entfernen. Mit einem Rongeur die Dornfortsätze von der L6 bis zur unteren Brustwirbelsäule extrahieren. Führen Sie die untere Spitze des Rongeurs unter die L5-Lamina ein und entfernen Sie methodisch den Knochen über dem Rückenmark, indem Sie mehrere Bissen aus ihm herausnehmen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Delivering Gene Therapy Vectors via Lumbar Puncture in the Juvenile Rat

Intrathecal Vector Delivery in Juvenile Rats via Lumbar Cistern Injection

Gene therapy is a powerful technology to deliver new genes to a patient for the treatment of disease, be it to introduce a functional gene, inactivate a ...

Forschung

Neurowissenschaften

Preparing Reagents to Deliver an Adeno-Associated Serotype 9 Vector

Vorbereitung von Reagenzien zur Verabreichung eines Adeno-assoziierten Serotyp-9-Vektors