For at begynde skal du få lændeområdet af hvalpens rygrad i en skål, der indeholder et koldt dissektionsmedium. Brug et dissektionsstereomikroskop og en mikrosaks til at skære rygraden langs sagittalaksen. Fjern forsigtigt rygmarven fra rygraden med en lige pincet og skræl forsigtigt hjernehinderne af fra den isolerede lænderegion af rygmarven eller SC. Overfør og inkuber det isolerede SC-lændeområde i koldt og frisk dissektionsmedium i 10 til 15 minutter.
Brug en Pasteur-pipette af plastik til at placere vævet på skæredækket på hakkeinstrumentet vinkelret på bladet. Når du har fjernet det resterende dissektionsmedium, skal du fortsætte med den automatiske sektionering af SC. Brug en Pasteur-pipette til at overføre skiverne og inkubere dem med frisk dissektionsmedium i en 35 millimeter skål i 15 minutter. Vask overfladen af dyrkningsmembranindsatsen tre gange med organotypisk medium eller OM, og lad en milliliter medie ligge i bunden af membranindsatsen.
Undersøg skiverne under dissektionsstereomikroskopet, og så det ønskede antal skiver på de konditionerede membranindsatser. Efter justering af skivernes retning og fjernelse af overskydende medium, inkuberes de ved 37 grader Celsius i 30 minutter. Overfør derefter indsatsen til en ny petriskål og tilsæt en milliliter frisk OM suppleret med GDNF i bunden af membranindsatsen.
Inkuber skiverne ved 37 grader Celsius. På dag ex vivo et skal du udskifte det gamle medium med frisk OM. På dag tre skal du skifte til graftmedium suppleret med GDNF og tilføje frisk GDNF til mediet hver dag indtil dag ex vivo syv. For resten af den langsigtede dyrkning skal du kun tilføje GDNF, når mediet ændres.
Immunfluorescensanalyse af langtidsdyrkede mus SC organotypiske skiver afslørede en bred fordeling af den cytoskeletale markør neurofilament og den nukleare neuronale markør RBFOX3, hvilket vidner om deres sunde tilstand og neuronale identitet.