Um die funktionelle Charakterisierung von aus Maus-Fettgewebe gewonnenen Stammzellen durch osteogene Differenzierung durchzuführen, werden die Zellen zunächst mit Trypsin-EDTA abgelöst. Sammeln Sie die trypsinisierten Zellen in einem konischen Röhrchen. Setzen Sie dann die Zellen in die Vertiefungen einer sechswandigen Platte mit Basalmedium ein.
Inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius unter 5% Kohlendioxidzusatz. Ersetzen Sie nach 24 Stunden das Medium durch osteogenes Medium. Anschließend färben Sie die Zellen mit Von Kossa-Färbung, um die mineralisierten Knötchen zu beurteilen.
Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS, nachdem Sie das Medium angesaugt haben. Fixieren Sie die Zellen in zwei Millilitern 70%igem Ethanol über Nacht bei Raumtemperatur. Geben Sie anschließend zwei Milliliter 5%ige Silbernitratlösung in die Vertiefungen.
Nachdem Sie die Zellen mit destilliertem Wasser gewaschen haben, inkubieren Sie die Zellen fünf Minuten lang in zwei Millilitern 5%igem Natriumthiosulfat. Färben Sie die gewaschenen Zellen 40 Sekunden lang mit zwei Millilitern Eosin. Nachdem Sie den Fleck abgewaschen haben, legen Sie die Platte unter ein optisches Mikroskop, um die Fleckenzellen zu betrachten.
Die aus dem Fettgewebe gewonnenen Stammzellen zeigten eine Multipotenz zur Differenzierung in Osteoblasten, Adipoblasten und Chondroblasten. Die Von-Kossa-Färbung zeigte das Vorhandensein von mineralisierten Knötchen, die für Osteoblasten charakteristisch sind. Die adipogenen Zellen zeigten das Vorhandensein von Lipidvakuolen im Zytoplasma der Stammzellen, während die Alcian-Blaufärbung das Vorhandensein von Glykosaminoglykanen in der extrazellulären Matrix zeigte.