Начните с трансфекции HEK 293 Т-клеток. Через три дня после трансфекции удалите среду из лунок и промойте один раз PBS. Добавьте в каждую лунку по 500 микролитров трипсина.
Инкубируйте в течение пяти минут при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы отделить все клетки от пластины. Затем добавьте в каждую лунку по 500 микролитров полной среды DMEM и ресуспендируйте клетки. Переложите все ячейки из каждой лунки в центрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитров.
Затем центрифугировать в течение двух минут при 1000 г при комнатной температуре. Осторожно удалите надосадочную жидкость с помощью пипетирования и промойте гранулу один раз одним миллилитром PBS. Снова осторожно удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в 500 микролитрах PBS.
Перенесите элементы в трубки FACS. Провести анализ клеток с помощью проточного цитометра. Загрузите нерезецированную клеточную суспензию.
На листе проточной цитометрии нажмите Получить и отрегулируйте напряжение прямого и бокового рассеяния. Чтобы расположить клетки в средней области, затвор вокруг этой популяции R1, чтобы исключить мусор в нижнем левом квадранте. Поменяйте затвор FL1, FL2 dot blot на G R1. Выберите инструмент для создания четырехугольного стробирования и щелкните по верхнему правому крайнему углу популяции клеток в точечном блоттинге FL1/FL2 как G R1. Отрегулируйте напряжения FL1/FL2, чтобы расположить элементы в нижнем левом квадранте.
Нажмите кнопку Пауза и Прервать. Затем загрузите одноцветные ячейки управления GFP. Нажмите кнопку Получить и отрегулируйте компенсацию, чтобы расположить положительные ячейки GFP в правом нижнем квадранте.
Нажмите кнопку Пауза и Прервать. Далее загрузите одноцветные ячейки управления mCherry. Нажмите кнопку Получить и отрегулируйте компенсацию, чтобы расположить положительные ячейки mCherry в верхнем левом квадранте.
Нажмите кнопку Пауза и Прервать. Нажмите «Получить» в строке меню и выберите «Хранилище данных». В разделе Критерии сбора выберите Сбор данных будет остановлен, когда будет подсчитано 10 000 событий G1 R1.
Отмените флажок в поле Настройка. Загрузите ячейки с образцами. Нажмите Получить и подождите, пока не будет подсчитано 10 000 ячеек G1 R1.
Повторите то же самое для других образцов и контрольных образцов.